歡迎您訪問愛非克（深圳）生物科技有限公司
yzh@akkpro.com
AKK菌或能改善代謝功能障礙引起的脂肪肝
2021-12-06
關鍵詞：AKK菌、AKK菌格林汁
代謝功能障礙相關的脂肪肝（MAFLD）是一種以大量脂質蓄積為特征的代謝綜合征，包括單純性脂肪變性（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、纖維化和肝硬化，甚至肝細胞癌（HCC）。MAFLD已成為一種主要的肝臟疾病，在全球成年人中的患病率為22-29%，其中超過75%的人超重和肥胖。然而，迄今為止，還沒有獲批的藥物可用于MAFLD治療。
腸道細菌AKK菌因其在治療代謝紊亂方面的潛力而得到越來越多的認可，研究表明，通過直接用AKK菌治療或通過飲食或藥物干預增加其在腸道中的豐度，可有效治療MAFLD。
該研究通過使用高脂肪和高膽固醇（HFC）飲食誘導的肥胖小鼠為模型，評估了AKK菌的治療特性，同時運用代謝組學分析鑒定與MAFLD治療相關的重要代謝物來研究AKK菌的分子作用模式。
研究內容
將7-8周齡的C57BL/6小鼠（18-20 g）飼養在無特定病原體的環境中，并按照標準化方法在22 ± 1 ℃下以12小時光/暗循環飼養，可自由獲取食物和水。
在適應環境1周后，小鼠隨意飼喂60%高脂肪和1.2%膽固醇（HFC）飲食17周，HFC喂養的小鼠在第11周被隨機分成兩亞組：接受磷酸鹽緩沖液（PBS，對照組）或A. muciniphila治療（處理組），分別處理6周。A. muciniphila溶解在無氧的PBS后最終濃度為1×108 CFU/ml，每隔一天給予小鼠懸浮液200 μL。對照組小鼠給藥相同體積的PBS。
另外，對于無菌小鼠模型，在第11周前1周，HFC小鼠口服抗生素混合物Abx（含有氨芐青霉素 0.2 g/L、萬古霉素 0.2 g/L、硫酸新霉素0.2 g/L和甲硝唑0.2 g/L），然后再接受單獨的Abx或A. muciniphila治療6周。Abx溶解在飲用水中。每天監測小鼠體重。
研究結束后，小鼠禁食8小時并通過i.p.注射80 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg甲苯噻嗪進行麻醉。當小鼠完全麻醉后，取出眼球收集血液樣本用于測量肝臟相關酶，收集肝臟組織測定甘油三酯（TG）和二?；视停―AG），并且進行組織學檢查和免疫組織化學評估以及免疫印跡分析，從糞便樣本中提取細菌DNA進行16S rRNA測序，收集肝臟中的代謝物進行代謝組學分析，通過L-天冬氨酸ELISA試劑盒測量肝臟、糞便和血漿中的L-天冬氨酸水平。
研究結果
灌胃A. muciniphila減輕肥胖小鼠的MAFLD
檢查HFC小鼠糞便中腸道微生物群的組成發現，HFC小鼠和A. muciniphila處理的HFC小鼠的兩個不同集群顯示兩組之間微生物群落結構存在顯著差異。α-多樣性分析顯示A. muciniphila灌胃增加了小鼠體內腸道菌群的豐富度和多樣性，并改善微生物群落結構。值得注意的是，通過LEfSe分析，A. muciniphila被鑒定為杰出的微生物群成分之一。
接下來評估A. muciniphila在HFC飲食喂養誘導的肥胖小鼠模型中治療MAFLD的效果，定量聚合酶鏈反應（qPCR）結果顯示，與HFC組小鼠相比，A. muciniphila處理有效地使腸道中A. muciniphila的豐度增加了20倍，這種活動導致小鼠體重下降，A. muciniphila治療6周后HFC小鼠體重下降約20.8%。有趣的是，A. muciniphila治療通過降低肝TG有效減輕HFC小鼠的肝脂肪變性，在肥胖小鼠中用A. muciniphila治療顯著降低肝臟中DAG的水平。測定血漿中肝臟特異性酶的水平顯示，A. muciniphila顯著改善HFC小鼠的肝損傷，天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）和堿性磷酸酶（ALP）水平都降低。此外，病理檢查進一步證實A. muciniphila在改善小鼠MAFLD的所有表型方面的治療作用。
為了探索A. muciniphila的這些抗MAFLD作用是否依賴于藥物治療，HFC小鼠用A. muciniphila口服治療6周后再停用A. muciniphila 4周。有趣的是，A. muciniphila戒斷導致其抗MAFLD活性的有效持久性，戒斷后小鼠體重、肝臟TG水平以及血漿AST、ALT和ALP水平顯著降低。病理檢查進一步證實A. muciniphila戒斷導致小鼠持續抗MAFLD活性。A. muciniphila處理的HFC小鼠中的這些保持治療效果與A. muciniphila豐度更高相關。
為進一步確定A. muciniphila在抗生素（Abx）處理的HFC小鼠中的抗MAFLD特性，在小鼠中用Abx處理降低A. muciniphila的豐度及其在腸道中增殖，這導致小鼠肝損傷和MAFLD表現加重，如Abx處理的HFC小鼠肝臟重量增加、肝臟TG大量積累和肝損傷。此外，與HFC小鼠或Abx處理的HFC小鼠相比，Abx+A. muciniphila共同處理組仍有顯著的MAFLD衰減作用?；虮磉_分析進一步證實A. muciniphila下調FAS、ACC、TNF-ɑ、IL-6和MCP1基因的表達水平。綜上所述，用A. muciniphila治療可有效減輕小鼠的MAFLD。
圖1 A. muciniphila減輕由HFC飲食喂養誘導的肥胖MAFLD
圖2 A. muciniphila增加與HFC小鼠肝臟和腸道脂質代謝相關的標志物
A. muciniphila激活腸-肝軸中的脂質氧化并維持腸道屏障完整性
用A. muciniphila處理的小鼠表現出線粒體拷貝數增加，并且激活參與肝臟脂質轉運[脂肪酸轉運蛋白4（FATP4），脂肪酸轉位酶/分化簇36（FAT/CD36）]和氧化[脂蛋白脂肪酶（LPL），過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1ɑ（PGC-1ɑ）、解偶聯蛋白2（UCP2）、肉堿棕櫚酰轉移酶1β（CPT-1β）和肝X受體（LXR）]的基因網絡。免疫印跡分析顯示，在小鼠中用A. muciniphila治療激活肝激酶B1（LKB1）-AMPK軸，并增加肝臟中能量代謝調節因子（PGC-1ɑ和CPT-1β）和線粒體復合物（I、II、IV和V）的表達。
A. muciniphila減輕肥胖小鼠腸肝軸膽汁酸代謝功能障礙
探索A. muciniphila對腸-肝軸膽汁酸代謝的調節作用發現，A. muciniphila治療導致肝臟中與膽固醇轉運相關基因的表達水平增加，如低密度脂蛋白受體（LDLR），這表明A. muciniphila治療能促進小鼠肝臟中膽固醇的轉運，同時還激活一個參與膽汁酸合成和運輸的基因。另外，灌胃A. muciniphila后HFC小鼠回腸和肝臟中膽汁酸調節基因的表達水平增加，如ASBT、IBABP、OSTβ、NTCP和OATP。此外，A. muciniphila治療增強膽固醇轉運[Niemann-Pick型C1樣細胞內膽固醇轉運蛋白1（NPC1L1）的水平增加]并降低回腸中膽汁酸合成相關基因的表達水平。與膽固醇轉運調節因子（LDLR）表達水平的改變一致，A. muciniphila處理降低HFC小鼠血漿和肝臟中膽固醇的水平，表明A. muciniphila有利于腸-肝軸的膽汁酸代謝。此外，用A. muciniphila治療的小鼠結腸中編碼粘蛋白的基因mucin 2、mucin 4、mucin 5ac、mucin 5b和mucin 20的表達水平增加，粘蛋白是A. muciniphila在腸道中生長和增殖的關鍵底物，這一結果與之前的報道一致。
圖3 A. muciniphila促進HFC小鼠肝臟和腸道中膽汁酸的代謝
圖4 A. muciniphila增加HFC小鼠肝臟中的 L-天冬氨酸水平
A. muciniphila通過促進L-天冬氨酸從腸道轉運來增加肝臟L-天冬氨酸水平
代謝組學分析肝臟中的代謝特征發現，主坐標分析（PCA）顯示HFC+A. muciniphila（與HFC組相比）、HFC+Abx（與HFC組相比）和HFC+Abx+A. muciniphila（與HFC+Abx組相比）的化學成分存在顯著差異。與HFC小鼠相比，用A. muciniphila處理的小鼠表現出不同的代謝特征，檢測到247種具有顯著差異的代謝物（86種下調和161種上調），根據KEGG數據庫對鑒定的代謝物進行分類，總共有98種代謝物被歸入前20個KEGG二級通路；此外，與單獨用Abx治療的HFC小鼠相比，在A. muciniphila+Abx組的肝臟中檢測到更顯著不同的代謝物，總共檢測到628種顯著不同的代謝物（105種下調，523種上調），這些改變的代謝物被注釋為與肝臟代謝相關，如脂肪分解、脂肪消化和吸收、胰島素抵抗和膽汁酸生物合成。
進一步測定血漿和糞便中L-天冬氨酸的水平發現，A. muciniphila治療有效地增加了血漿和糞便中的L-天冬氨酸水平，而Abx處理也增加糞便中的L-天冬氨酸水平，但降低血漿和肝臟中的L-天冬氨酸水平。L-天冬氨酸轉運蛋白（Slc1a1或Slc1a2）在回腸或肝臟中的基因表達表明，用A. muciniphila治療的小鼠Slc1a1 或 Slc1a2的表達水平增加，而Abx處理后L-天冬氨酸轉運蛋白的表達水平降低，并部分地消除A. muciniphila對增加L-天冬氨酸轉運蛋白基因表達的刺激作用。
L-天冬氨酸直接激活脂質氧化和LKB1-AMPK軸
通過在體外模擬肝脂肪變性的細胞模型，在油酸（OA）誘導的情況下將L-天冬氨酸暴露于肝細胞（L-02細胞），TG測定和尼羅紅染色發現添加L-天冬氨酸有效降低了細胞脂質水平,這種減少發生在代謝能量調節因子（PGC-1α）和線粒體復合物的表達水平增加以及LKB1-AMPK軸的激活，導致氧化應激的抑制，活性氧（ROS）水平降低。這種有益的代謝作用也在OA誘導的腸細胞中出現。這些新發現與L-天冬氨酸在激活HCT-116細胞中LKB1-AMPK 軸中的代謝作用非常吻合。
為了進一步闡明L-天冬氨酸在體內的直接代謝作用，小鼠口服L-天冬氨酸24小時，結果表明L-天冬氨酸轉運蛋白基因的表達在轉錄水平被有效激活，導致肝臟中L-天冬氨酸水平的增加。此外，L-天冬氨酸治療激活與肝臟能量氧化相關的基因網絡，如PGC-1α、UCP2和CPT-1β。PGC-1α和UCP2的免疫組織化學分析進一步證實L-天冬氨酸在肝臟中的直接代謝有益作用，這些代謝改善導致內源性肝TG水平略有降低，而沒有肝損傷。
然后探討了L-天冬氨酸在MAFLD中的治療效果，正如預期的那樣，在HFC小鼠中灌胃L-天冬氨酸（200 mg/kg）有效地防止肝臟重量增加并改善肝損傷和肝脂肪變性。HFC小鼠肝臟TG水平的定量和血漿肝臟特異性酶水平（AST、ALT、ALP）的測定進一步證實L-天冬氨酸在體內的抗MAFLD活性，表明L-天冬氨酸是治療MAFLD的有效藥物。
圖 L-天冬氨酸可降低肝細胞中的脂質和ROS，同時增加LKB1-AMPK活性和線粒體氧化能力
結論
用A. muciniphila治療的小鼠有效逆轉了肥胖小鼠肝臟中的MAFLD，如肝脂肪變性、炎癥和肝損傷。這些治療效果在長期停藥后仍然存在，并且在抗生素處理的肥胖小鼠中略有減弱。A. muciniphila治療有效地增加了腸-肝軸中的線粒體氧化和膽汁酸代謝，改善了氧化應激誘導的腸道細胞凋亡，導致腸道微生物群組成的重塑，這些代謝改善伴隨著從腸道轉運的肝臟中L-天冬氨酸水平的增加而發生。L-天冬氨酸的體外給藥或在小鼠中灌胃顯示出上述類似的有益代謝作用并有效改善MAFLD。總之，這些數據表明A. muciniphila的抗MAFLD活性與脂質氧化相關，并通過調節L-天冬氨酸的代謝改善腸-肝相互作用。A. muciniphila可能是MAFLD臨床干預的潛在藥物。
圖 A. muciniphila改善HFC飲食誘導的肥胖小鼠MAFLD 的建議機制
研究報告原文詳見：
文章僅供學術探討，如需轉載請注明出處。
Copyright ? 2022 愛非克（深圳）生物科技有限公司
愛非克生物科技
AKK菌格林汁