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調節腸道AKK菌能夠改善部分潰瘍性結腸炎
2021-11-30
關鍵詞：AKK菌、AKK菌格林汁
炎癥性腸病（IBD），包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD），在過去50年中已發展成為一種全球性疾病，在全球范圍內的發病率和流行率不斷增加。
與粘膜免疫和宿主代謝相關的腸道微生物群可能是IBD發病機制中最關鍵的環境因素，Marion-Letellier等人證實，腸道微生物群在IBD患者結腸炎的嚴重程度和進展中起著關鍵作用。
AKK菌是疣微菌門的代表細菌，占人類腸道微生物群落的1-5%，代謝紊亂中通過腸道微生物與宿主之間的相互作用在維持腸道屏障功能、宿主代謝和其他生物功能方面發揮重要作用。
研究發現，炎癥性腸病患者的AKK菌的豐度降低，表明AKK菌可能在防止炎癥性腸病IBD中發生腸道損傷方面發揮關鍵作用。
AKK菌給藥，能夠使血清和結腸組織中炎癥細胞因子和趨化因子（TNF-α、IL1α、IL6、IL12A、MIP-1A、G-CSF和KC）的水平降低，通過減輕體重減輕、結腸長度縮短和組織病理學評分以及屏障功能增強來證明改善炎癥性腸病IBD。
研究內容
5周齡的無特定病原體（SPF）雄性C57BL/6小鼠在SPF條件下常規飼養，并在小鼠6-7周齡時進行實驗。24只小鼠隨機分為三組（每組n =8）：正常對照組（CP組）、實驗模型組（DP組）和A. muciniphila組（AKK組）。AKK組（DSS + A. muciniphila）中的小鼠每天口服管飼0.2 ml A. muciniphila MucT (ATTC BAA835)（3 × 109 CFU）一次，DP組（DSS + PBS）和CP組（水+ PBS）中的小鼠則給予等量的厭氧無菌PBS，持續14天（第-7天至第7天）。在第0天，AKK組和DP組的小鼠口服含2%（wt/vol）DSS的飲用水，持續7天（第0天至第6天) ，然后正常飲水2天。同時，CP組小鼠給予正常飲水9天（第0-8天）。在整個實驗過程中記錄小鼠體重，并在第0天和第8天收集糞便樣本。通過異硫氰酸熒光素偶聯葡聚糖（FITC-葡聚糖）法測定腸道通透性，使用結腸炎的疾病活動指數（DAI）評估測量結腸炎的嚴重程度。在實驗結束時（第8天），所有小鼠在收集血清和結腸段后被安樂死。收集的結腸段用于組織病理學、免疫熒光分析以及結腸mRNA表達的測定，收集血清進行參數分析，糞便用于微生物群落分析以及短鏈脂肪酸定量分析。
研究結果
A. muciniphila減輕DSS誘導的結腸炎
DSS模型建立期間的體重減輕可用作結腸炎嚴重程度的度量。從第2天開始，DP組小鼠的體重持續下降，而AKK組小鼠的體重減輕有顯著改善，盡管第6天有明顯下降。實驗中，與DP組小鼠相比，AKK組小鼠的體重減輕減少。在結腸炎模型中，疾病嚴重程度通常與腸道炎癥引起的結腸長度縮短有關。在DSS暴露7天后，DP組小鼠的結腸比CP組和AKK組更短。重要的是，給予DSS會導致小鼠體重減輕和血性腹瀉，這些因素是與人類UC的某些臨床特征相似的炎癥相關參數，可用于計算DAI評分。在該研究中，隨著DSS給藥時間的延長，DP組小鼠的評分明顯高于CP組和AKK組。
所有化學誘導的結腸炎模型，包括口服DSS，都是從破壞上皮屏障開始的。H&E結腸染色結果顯示DSS誘導的結腸炎導致潰瘍延長、隱窩破壞和透壁炎癥浸潤，粘膜結構幾乎不完整。然而，在用A. muciniphila治療的小鼠中，組織學損傷得到改善，這可以通過保留的粘膜結構顯示出局灶性糜爛和輕度/中度粘膜炎癥浸潤來證明。使用組織病理學評分（0-6）系統評估腸粘膜結構（0-3） 和炎癥浸潤（0-3），結果顯示，用A. muciniphila治療的小鼠的得分顯著低于僅接受DSS處理的小鼠。
圖 Akkermansia muciniphila減輕DSS誘導的結腸損傷
圖 Akkermansia muciniphila改善小鼠結腸黏膜屏障損傷
A. muciniphila改善小鼠結腸粘膜屏障損傷
結腸上皮破壞和炎癥活動增加了腸道細菌易位的風險，進而加重結腸炎的嚴重程度。因此，通過ELISA測量血清脂多糖（LPS）結合蛋白（LBP）以評估細菌易位和結腸炎活性，結果顯示DP組血清LBP水平高于CP組和AKK組。
腸黏膜屏障破壞與結腸炎進展有關。通過定量PCR和免疫熒光測定結腸中連接蛋白（occludin、ZO-1和claudin-4）的表達，結果發現，DP組結腸組織中Claudin-4 mRNA的表達降低，相比之下，AKK組的水平上調。值得注意的是，與CP組相比，DP組結腸中occludin mRNA的表達下調。然而，在AKK和DP組之間沒有發現occludin和ZO-1 mRNA表達的顯著差異。DP組中的結腸組織呈現出增加的TJ結構缺陷，隱窩被破壞和頂端區域被破壞，而A. muciniphila給藥穩定了粘膜完整性，導致occludin和ZO-1的平滑和連續定位。
此外，大麻素受體CB1和CB2與維持腸道通透性和血漿LPS水平呈正相關。與血清LBP水平一致，DSS處理后這兩個標記物（CB1和CB2）的表達顯著增加，而在用A. muciniphila治療的小鼠中表達下調。值得注意的是，FITC-葡聚糖分析顯示，與DP組相比，AKK組小鼠的腸道通透性降低，表明A. muciniphila治療后屏障功能增加。
圖3 Akkermansia muciniphila增強腸道屏障功能
圖4 Akkermansia muciniphila表現出全身和腸道抗炎作用
A. muciniphila治療導致全身和腸道抗炎
為探索A. muciniphila治療是否可以通過調節炎癥來緩解結腸炎，該研究檢測了血清細胞因子和遠端結腸組織中細胞因子的表達。在僅DSS處理的小鼠中（DP vs. CP）觀察到血清細胞因子增加，包括促炎細胞因子TNF-α、IL1α、IL6和IL12A，以及趨化因子MIP-1A、G-CSF和KC。在AKK組中，這些細胞因子顯著下調，其水平與CP組相似。此外，在結腸組織炎癥表達中也發現了類似的結果。與CP組相比，DP組TNF-α、IL12A和INFγ的表達水平顯著上調。相比之下，與DP組相比，口服A. muciniphila后TNF-α、IL12A和INFγ的表達下調，并且幾乎降至正常水平。IL1α、IL6和MIP-1A顯示出類似的下降趨勢。此外，用A. muciniphila治療小鼠后血清和結腸組織中免疫調節細胞因子IL10的表達水平增加。
A. muciniphila減輕DSS誘導的微生物群失調并重塑腸道微生物群落
腸道微生物是腸道炎癥的重要因素。為進一步探索A. muciniphila治療對DSS誘導的結腸炎小鼠的保護作用，該研究對三組的糞便樣本進行16S rRNA測序分析以評估腸道微生物群的變化。三組的稀少曲線反映了糞便分析的測序深度，總共獲得1285692 reads（AKK = 431984，CP = 427244，DP = 426464）用于進一步分析，11982個已識別的OTUs（AKK = 3853，CP = 4530，DP = 3599）聚類相似度截止點為97%。與CP組相比，DSS處理小鼠（DP組）的糞便微生物組表現出降低的α多樣性，這反映在觀察到的物種和Ace、Chao1和香農指數降低。在用A. muciniphila處理的小鼠中（AKK vs. DP），香農指數顯著高于未用A. muciniphila處理的小鼠。接下來，該研究進行加權UniFrac PCoA分析腸道微生物群落（β多樣性）中物種復雜性和結構改變的差異，結果顯示三組之間的β多樣性存在顯著差異，DP組樣品與CP組樣品分開。同樣，AKK和DP組樣品的微生物群清楚地分為兩個集群，表明連續施用A. muciniphila緩解了DSS誘導的腸道微生物群失調。
IBD患者中細菌類群的相對豐度發生改變。因此，該研究使用Wilcoxon秩和檢驗來比較三組之間的相對分類群豐度。在門水平上，與CP組相比，由于DSS處理，Firmicutes的豐度降低，Bacteroidetes的豐度增加 (F/B < 1)。在連續施用A. muciniphila后，Firmicutes的比例顯著增加，Bacteroidetes減少。此外，由于治療，Bacteroidetes的豐度也增加。在科層面，與DP組相比，AKK組瘤胃球菌科的相對豐度增加，而Rikenellaceae和Enterobacteriaceae的相對豐度有所降低，但沒有顯著差異。在屬水平上，AKK組糞便菌群中Oscillibacter的豐度顯著高于DP組和CP組。
圖左 A. muciniphila緩解了DSS誘導的微生物群失調
圖右 Akkermansia muciniphila重塑了腸道微生物群落
該研究進行LEfSe分析，以從三組之間的微生物豐度分析中探索預后生物標記物。結果發現，A. muciniphila治療后Clostridia、Firmicutes、Ruminococcaceae、Oscillibacter、Verrucomicrobia和Akkermansia的豐度增加，Bacteroidetes的豐度減少。有趣的是，由于DSS處理，糞便菌群Enterobacteriales、Escherichia Shigella和Erysipelotrichales富集，并且Lactobacillales、Rikenellaceae和Lachnospiraceae減少。至于京都基因和基因組百科全書（KEGG）代謝途徑，在DP和AKK組之間觀察到了幾個預測的功能差異，例如NOD樣受體信號通路、糖胺聚糖降解途徑和脂質代謝途徑
在該研究中，從三組的24個糞便樣本中共鑒定出六種短鏈脂肪酸（SCFA），包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、2-甲基丁酸和戊酸。與DP組相比，AKK組的乙酸、丙酸、異丁酸和丁酸的水平顯著升高。然而，在A. muciniphila處理下，2-甲基丁酸和戊酸的水平沒有變化。
圖 在三組中觀察到的短鏈脂肪酸（SCFA）分布
圖 腸道菌群與結腸炎參數的相關性分析
相關性分析表明A. muciniphila修正的腸道微生物群在DSS誘導的結腸炎的進展中發揮重要作用
通過腸道細菌豐度和結腸炎參數之間的相關性分析驗證改變的微生物群落與結腸炎嚴重程度的相關性，結果顯示，A. muciniphila修正細菌的相對豐度與腸道屏障標志物和相關的炎性細胞因子有關。作為代表性結腸炎嚴重程度標記物之一，TNF-α與Verrucomicrobia、Ruminococcaceae_UCG-014和Akkermansia呈負相關。此外，主要促炎細胞因子IL12（p40）與Ruminococcaceae_UCG-014、Verrucomicrobia、Akkermansia和 Rikenellaceae_RC9_gut_group的種群密度呈負相關。值得注意的是，該研究發現Verrucomicrobia在AKK組中顯著豐富，并且與所有測試的腸道屏障標志物（claudin-4、LBP和CB1）和炎性細胞因子（包括TNF-α、IFN-γ、IL12（p40）、IL1α和IL6）顯著負相關。相比之下，在DP組中富集的Bacteroides與MIP-1α、IL1α和LBP呈正相關。抗炎細胞因子 IL10，因A. muciniphila給藥而上調，與Verrucomicrobia、Ruminococcaceae_UCG-014和Akkermansia顯著正相關。
綜上所述
A. muciniphila改善了DSS誘導的結腸炎，這可以通過減輕體重減輕、結腸長度縮短和組織病理學評分以及屏障功能增強來證明。因為 A. muciniphila給藥，血清和結腸組織中炎癥細胞因子和趨化因子（TNF-α、IL1α、IL6、IL12A、MIP-1A、G-CSF和KC）的水平降低。16S rDNA序列分析表明A. muciniphila誘導顯著的腸道微生物群改變。此外，相關性分析表明，促炎細胞因子和其他損傷因子與Verrucomicrobia、Akkermansia、Ruminococcaceae和Rikenellaceae呈負相關，它們在A. muciniphila處理的小鼠中顯著豐富。總之，該研究證實，A. muciniphila治療可以通過微生物-宿主相互作用（保護腸道屏障功能并降低炎性細胞因子的水平）或通過改善微生物群落來改善粘膜炎癥。A. muciniphila對DSS誘導的小鼠結腸炎發揮保護作用，表明A. muciniphila可能是改善結腸炎的潛在益生菌劑。
研究報告原文詳見：
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