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AKK菌通過降低腸道通透性和炎癥促進H型血管形成和骨折愈合
2021-12-15
隨著工業及交通快速發展，外傷事故發生率逐年增加，骨折發生率也增高。雖然治療骨折的技術和植入材料有所改進，但仍有許多患者出現愈合延遲或骨不連，造成了巨大的醫療和經濟成本。
改善血運重建是骨折治療的主要措施之一，中度局部炎癥會觸發血管生成，而全身性或額外的局部炎癥會抑制血運重建并損害骨折愈合。既往研究表明，一種名為H型的特定血管亞型，其高度表達血小板-內皮細胞粘附分子（CD31）和內粘蛋白（Emcn），可將血管生成和成骨結合起來。
AKK菌是一種腸道益生菌，多項研究表明A. muciniphila具有廣泛的生物活性，可通過收緊腸道屏障來改善全身炎癥。
在一項對骨折小鼠愈合的影響實驗中，用A. muciniphila胃內給藥的骨折小鼠比用PBS處理的小鼠表現出更好的骨折愈合，且誘導了更多的血小板源性生長因子BB（PDGF-B）陽性的破骨細胞，與H型血管形成增加相吻合。
此外， 研究使用葡聚糖硫酸鈉（DSS）來破壞腸道屏障，結果表明A. muciniphila治療顯著改善DSS處理的腸道屏障，減輕炎癥，并恢復小鼠受損的骨骼愈合和血管生成。這些結果都表明A. muciniphila有潛力作為一種很有前途的骨愈合策略。
研究內容
A. muciniphila對骨折愈合的影響實驗：C57BL/6雌性小鼠（8周齡）戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射全身麻醉后，開切口后使用鋒利的剪刀在股骨的中軸上造成橫向骨折，確認骨折完全后，縫合傷口。小鼠分為A. muciniphila（ATCC, BAA-835）、L. gasseri (ATCC, 33323)和PBS組，分別給予0.5 ml含8×108 CFUs A. muciniphila或L. gasseri的PBS，或等體積的PBS，每周處理兩次，共6周。
ABX處理實驗：小鼠分為兩組：ABX+PBS和ABX+A. muciniphila。所有小鼠均服用含有萬古霉素（0.5 g/l）、氨芐青霉素（1 g/l）、新霉素（1 g/l）和甲硝唑（1 g/l）的廣譜抗生素混合物（APX）的飲用水2周，然后是2天的洗脫期。將糞便樣品置于培養基進行96小時厭氧培養以確保糞便微生物群耗竭。然后對所有小鼠進行骨折手術。ABX+A. muciniphila組小鼠在手術當天開始口服灌胃0.5 ml含8×108 CFUs A. muciniphila的PBS，ABX+PBS組給小鼠等體積的PBS，每周2次，共6周。
DSS實驗：所有小鼠分為3組：PBS組、DSS+PBS組和DSS+A. muciniphila組。骨折手術前對DSS+PBS組和DSS+A. muciniphila組進行為期7天的DSS處理，將2.5%（w/v）DSS隨意添加到飲用水中。手術后進行3個周期的治療（8天正常飲水，6天DSS）直至實驗結束。在整個實驗過程中，PBS組的小鼠接受正常的飲用水。DSS+A. muciniphila組小鼠每周口服施用0.5 ml含8×108 CFUs A. muciniphila的PBS兩次。PBS組和DSS+PBS組中的每只小鼠給予等體積的PBS。所有小鼠每周稱重兩次直至處死。
各個實驗小鼠在1、2、4和6 WPF時全身麻醉處死，眼球摘除術收集全血樣本進行分析，收集糞便微生物進行A. muciniphila定量和16S rDNA qRT-PCR分析，采集的骨折股骨進行顯微計算機斷層掃描（μCT）分析、生物力學測試以及組織學、免疫組織化學和免疫熒光分析。
研究結果
A. muciniphila治療的小鼠骨折愈合質量提高
提取從糞便微生物樣本培養的A. muciniphila DNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產物條帶在300 bps和400 bps之間，這與A. muciniphila基因組DNA中正向和反向引物之間的分數體積（329 bps）一致。qRT-PCR分析四個時間點（1、2、4 和 6 WPF）的糞便樣本表明，在2、4和6 WPF時添加A. muciniphila顯著提高了糞便中的A. muciniphila豐度。這些數據表明A. muciniphila已成功定植于小鼠的腸道。
為比較A. muciniphila組和PBS組之間的骨折愈合質量，通過μCT分析測量愈傷組織中的礦化骨量（BV）、總愈傷組織體積（TV）和BV/TV。結果顯示，在1 WPF時A. muciniphila組的TV大于PBS組；在4和6 WPF時A. muciniphila組的BV遠高于PBS組。A. muciniphila和PBS組小鼠的TV在2 WPF時達到峰值，然后逐漸下降，可能是由于愈傷組織重塑。A. muciniphila組的BV/TV值在1 WPF時略低，但在4 WPF和6 WPF時顯著高于PBS組，這歸因于后期A. muciniphila組的BV提升。
組織礦物質密度分析表明，A. muciniphila處理在6 WPF時增強了愈傷組織礦化。接下來在6 WPF時進行四點彎曲測試骨折股骨的生物力學特性，結果顯示A. muciniphila組骨折股骨的最大彎曲載荷顯著大于PBS組。這些結果表明，與PBS處理相比，補充A. muciniphila的小鼠股骨骨折模型在早期導致更多的愈傷組織形成，并在后期加速礦化。該研究還使用一系列特異性引物進行16S rDNA qRT-PCR分析，以確定A. muciniphila補充劑是否改變腸道微生物組，結果顯示A. muciniphila誘導放線菌顯著增加，這與前人研究一致。此外，A. muciniphila的定植降低了γ-Proteobacteria的豐度并導致擬桿菌增加。
為確認A . muciniphila的直接效果，使用抗生素混合物（ABX）消耗腸道微生物群后再將小鼠骨折并重新測試A. muciniphila的作用，結果顯示，A. muciniphila仍然促進ABX處理小鼠的骨折愈合。BV和TV均在6 WPF時升高，從而提高抗彎曲性能。qRT-PCR分析顯示A. muciniphila成功定植于ABX處理小鼠的腸道。這些結果表明A. muciniphila具有通過內源性微生物獨立的機制刺激骨折修復的能力。
圖 A. muciniphila治療可加速骨折愈合
圖右 A. muciniphila對股骨骨折小鼠上軟骨愈傷組織形成、成骨和破骨細胞形成的影響
A. muciniphila處理改善小鼠的骨形成
接下來研究A. muciniphila治療是否影響軟骨樣愈傷組織形成、骨形成和骨吸收。番紅O染色顯示，在2 WPF時，與PBS處理的小鼠相比，A. muciniphila處理小鼠的骨折愈傷組織中形成了更多的軟骨樣基質，這被認為有利于后期的骨化。一致地，骨鈣素（OCN）的免疫染色顯示，與PBS組相比，A. muciniphila組在6 WPF時愈傷組織區有更多的成骨細胞。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）結果表明，通過A. muciniphila處理，OCN（骨形成的血清標志物）的血清水平也顯著升高。TRAP染色表明TRAP+多核細胞（破骨細胞）在A. muciniphila和PBS組之間沒有統計學顯著差異。同時，在6 WPF時可以檢測到兩組之間血清中Ⅰ型膠原交聯C末端肽（CTX-1）沒有顯著差異。這些數據表明，補充A. muciniphila可改善早期和后期的骨折愈合，更好的骨修復可能歸因于骨形成的增加。
A. muciniphila處理刺激愈傷組織中H型血管的形成
H型血管負責支持骨形成，前破骨細胞可以釋放PDGF-BB來誘導H型血管的形成，從而減輕性類固醇缺陷小鼠的骨質流失。依據前人研究在2 WPF驗證前破骨細胞和破骨細胞的數量，TRAP染色顯示，與PBS處理的小鼠相比，2 WPF時A. muciniphila處理的小鼠骨折區域的編織骨表面上的破骨細胞明顯更多，而破骨細胞則更少。在2 WFP進行TRAP和PDGF-BB的聯合免疫染色，正如預期的那樣，檢測到A. muciniphila處理的編織骨表面上PDGF-BB陽性的前破骨細胞（TRAP+單核細胞）比PBS處理的小鼠中更多。接下來，為確定H型血管的形成，在2 WPF時對CD31和Emcn進行聯合免疫染色，數據顯示，與PBS處理的小鼠相比，A. muciniphila處理的小鼠骨折區域的總血管和H型血管的形成顯著更高，而非H型血管的形成在兩組之間相似。總之，A. muciniphila治療有效地促進愈傷組織中H型血管的形成，這可能歸因于骨折區域中PDGF-BB+前破骨細胞數量的增加。
圖 補充A. muciniphila刺激小鼠股骨骨折中的前破骨細胞和H型血管形成
圖 A. muciniphila治療減輕小鼠股骨骨折的局部炎癥反應
補充A. muciniphila的小鼠在骨折愈合的早期階段表現出較低水平的炎癥反應
過度炎癥被認為是骨折愈合過程中抑制血管形成的最重要的全身因素之一。鑒于A. muciniphila在體內的抗炎作用，該研究在2 WPF時測量了骨折部位的局部炎癥水平。免疫組織化學分析顯示，A. muciniphila組骨折區域中白細胞介素1β (IL1β)、IL6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的染色強度比PBS組弱。值得注意的是，所有這些促炎細胞因子以前都被證明會損害骨折愈合中的血管生成。
前破骨細胞生存、增殖和破骨細胞分化需要巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），而核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）是另一種關鍵的破骨細胞生成細胞因子。評估血清中M-CSF和RANKL的水平發現，這兩個因子在2 WPF時都被A. muciniphila顯著下調，此時A. muciniphila對骨折部位產生抗炎作用。該結果與之前的多項研究一致，炎癥可以刺激M-CSF和RANKL的產生，在沒有M-CSF的情況下，單獨的RANKL不能誘導破骨細胞生成。這些數據綜合表明，A. muciniphila治療的抗炎結果可能是更多數量的前破骨細胞和H型血管以及加速骨折愈合的原因。
A. muciniphila治療會降低腸道通透性和炎癥
由于骨折被證明會增加腸道通透性，該研究分析了一類緊密連接蛋白的腸道mRNA 表達，包括occludin、jam3、claudin2、claudin3和claudin 15。數據顯示在2 WPF時這些因子的腸道mRNA水平在A. muciniphila處理的小鼠中顯著高于PBS處理的小鼠。為進一步證實A. muciniphila誘導的腸道屏障改善，這兩組的小鼠在2和6 WPF時口服異硫氰酸熒光素-葡聚糖（FITC-葡聚糖），4小時后測試FITC-葡聚糖的血清濃度，結果顯示，PBS處理的小鼠在2 WPF時具有更高的FITC-葡聚糖血清水平，而在6 WPF時兩組之間的差異不顯著。鱟變形細胞裂解物（LAL）測定表明，與2 WPF而非6 WPF時的PBS處理相比，A. muciniphila處理導致循環LPS降低。相應地，與PBS處理的小鼠相比，在2 WPF時A. muciniphila處理小鼠的腸道促炎因子TNF-α和IL17a的mRNA水平顯著降低，但腸道抗炎因子IL10的mRNA水平顯著升高。在6 WPF時A. muciniphila處理的腸道屏障收緊作用和腸道抗炎作用不如在2 WPF時強。為測試A. muciniphila對全身炎癥的影響，通過ELISA測試血清樣品，結果表明，在早期階段，A. muciniphila升高抗炎因子IL10的水平并降低TNF-α和血清淀粉樣蛋白A3（SAA3）的水平，這兩個被認為會促進炎癥和刺激破骨細胞生成。綜上所述，A. muciniphila治療在早期降低了腸道通透性和全身炎癥，此時骨折區域的血管生成達到最高水平。
圖 A. muciniphila給藥可收緊腸道屏障并減少股骨骨折小鼠模型中的全身炎癥
圖 補充益生菌可促進骨骼修復和血管生成
補充益生菌促進骨折愈合
該研究重新評估了A. muciniphila對骨折愈合的影響，并增加一個L. gasseri治療對照組，來研究改善的骨折愈合是否是A. muciniphila所特有的，以及其他降低腸道通透性和炎癥的益生菌是否也可以促進骨骼修復。μCT掃描顯示，用L. gasseri治療的小鼠與PBS處理的小鼠相比，在2 WPF時表現出更高的BV和在6 WPF時更高的TV。生物力學測試還表明，L. gasseri治療小鼠的股骨比PBS處理小鼠的股骨具有更好的愈合質量。番紅O染色顯示在2 WPF時L. gasseri處理的骨折愈傷組織軟骨基質形成略有增加。該研究還發現在2 WPF時L. gasseri處理導致愈傷組織中產生更多的前破骨細胞。與A. muciniphila相似，L. gasseri處理也促進新血管的形成，尤其是H型血管。這些結果表明L. gasseri治療也具有改善骨折愈合的能力。
A. muciniphila治療挽救腸道屏障功能障礙引起的骨愈合障礙
為了解腸道屏障在骨折修復中的作用以及當腸道通透性增加時A. muciniphila是否仍然有效，使用DSS來破壞腸道屏障。DSS實驗顯示，所有接受DSS處理的小鼠在早期都表現出明顯較低的體重。然而，到第35天，DSS+A. muciniphila組的小鼠開始表現出比DSS+PBS組更高的體重。在實驗后期，DSS+A. muciniphila組的小鼠體重與PBS組相似。DSS處理顯著縮短了結腸，而A. muciniphila治療顯著減輕腸道損傷。結腸切片的蘇木精伊紅（HE）染色顯示，A. muciniphila在2 WPF和6 WPF時明顯挽救了DSS誘導的粘膜損傷和腸道炎癥。
圖 A. muciniphila保護免受DSS誘導的骨折愈合損傷
圖 A. muciniphila治療恢復H型血管形成并降低DSS治療小鼠的腸道通透性
μCT結果顯示在2和6 WPF下DSS+PBS組BV和TV減少，表明DSS阻礙骨愈合。DSS+A. muciniphila組小鼠的BV和TV比DSS+PBS組小鼠高得多，甚至在6 WPF時比PBS組小鼠的BV/TV略高。四點彎曲試驗表明A. muciniphila顯著增強DSS處理小鼠的生物力學特性。此外，番紅O和TRAP染色證明A. muciniphila處理恢復了軟骨樣基質的形成和前破骨細胞的數量。測試三組的血管生成顯示，DSS處理顯著減少新血管的形成，包括H型和非H型血管。A. muciniphila治療減弱DSS引起的血管生成損失，主要是H型血管。接下來測試一類腸道屏障和炎癥相關的mRNA表明，A. muciniphila治療收緊了受損的腸道屏障完整性并減少DSS處理小鼠的結腸炎癥。一致地，血清LPS和血清FITC-葡聚糖水平也表明A. muciniphila治療降低了腸道通透性。這些證據表明，A. muciniphila治療可以通過收緊腸道屏障和減少炎癥來促進骨骼修復和 H 型血管的形成。
研究結論
在該研究中，用A. muciniphila胃內給藥的骨折小鼠比用PBS處理的小鼠表現出更好的骨折愈合。值得注意的是，A. muciniphila在骨折后2周誘導了更多的血小板源性生長因子BB（PDGF-B）陽性的破骨細胞，與H型血管形成增加相吻合。此外，A. muciniphila治療在早期顯著降低腸道通透性和炎癥。硫酸葡聚糖鈉（DSS）破壞腸道屏障后，A. muciniphila治療明顯改善DSS處理的腸道屏障，減少了炎癥，并恢復小鼠受損的骨骼愈合和血管生成。這些結果表明A. muciniphila降低腸道通透性并減輕炎癥，這可能會在愈傷組織中誘導更多的 PDGF-BB+前破骨細胞和H型血管形成，從而促進骨折愈合。該研究為H型血管參與骨折愈合提供了證據，并表明A. muciniphila有潛力作為一種很有前途的骨愈合策略。
研究報告原文詳見：
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