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調節AKK菌豐度或可減輕急性結腸炎
2021-12-16
炎癥性腸病（IBD）包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD），其發展受到眾多復雜因素的影響，除了遺傳特征和環境因素外，腸道微生物群是一個新的關鍵因素。
UC與腸道菌群組成和代謝變化后的腸道菌群失調有關。腸道菌群紊亂導致有害細菌增多，使腸道穩態失衡。益生菌可以建立一個健康的生態系統，防止宿主遭受病原感染，保持腸屏障功能，調節局部免疫反應。
AKK菌是一種革蘭氏陰性且嚴格厭氧的細菌，于2004年首次從人臉中分離出來。它被廣泛認為是下一代益生菌（NGP）的有希望的候選者，在人類腸道中含量豐富。
近年來，AKK菌已被證明與人和鼠結腸炎有關。然而，其確切功能和潛在機制尚未被探索。
該研究發現，與GMrepo數據庫中的健康人相比，UC患者糞便中AKK菌的水平降低。口服A. muciniphila BAA-835菌株能通過激活NLRP3減輕DSS誘導的急性結腸炎，該研究為基于益生菌的結腸炎治療提供了新的前景，這將促進對AKK菌復雜特征的更深入了解，并為未來人類結腸炎的治療提供指導。
研究內容
GMrepo數據庫分析：從GMrepo數據庫中獲取健康和UC患者糞便樣本中微生物群的相對豐度。該研究先通過查閱樣本描述和臨床信息來評估數據質量。然后提取健康和UC患者中相對豐富的Lactobacillus lactis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium longum、Streptococcus salivarius、Faecalibacterium prausnitzii和A. muciniphila進行分析。
人體樣本采集：從在浙江大學醫學院（中國浙江）邵逸夫醫院接受結腸鏡檢查的12名UC患者獲得新鮮結腸組織。所有患者均首次經病理診斷，未服用抗炎或免疫抑制藥物，收集患者臨床特征。從人類糞便樣本中提取細菌DNA進行實時定量PCR進行細菌定量。
動物實驗：雄性C57BL/6小鼠（6-8周齡）在飲用水中喂食2 mg/ml鏈霉素3天，以確保常規微生物群的一致性，然后將它們隨機分配為A. muciniphila組和PBS組。A. muciniphila組管飼法喂養300 μl含A. muciniphila BAA-835（1×109 CFU）的PBS，而PBS組用300 μl PBS處理7天。然后給小鼠每天飲用3%葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）8天以誘發結腸炎。每隔一天對小鼠稱重。處死小鼠后，稱重結腸組織并測量長度，結腸組織進行組織學評估，稱重脾組織。對于NLRP3敲除小鼠模型，使用雄性C57BL/6J NLRP3tm1Bhk（NLRP3-/-）小鼠進行實驗。
細胞實驗：小鼠巨噬細胞系Raw264.7細胞自美國典型培養物保藏中心，在含有10%胎牛血清（FBS）和1%鏈霉素和青霉素的RPMI 1640培養基中培養。收集的腿骨髓腔細胞在含有小鼠巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF；20 ng/ml）的完全DMEM中培養，六天后通過流式細胞術對F4/80（1 μg/ml）確認巨噬細胞（BMDM），收集分化的BMDM用于進一步實驗。
免疫組織化學分析：在人和鼠結腸切片中進行免疫組織化學分析以確定NLRP3表達水平。
研究結果
UC患者中A. muciniphila的豐度降低
分析GMrepo數據庫中正常人和UC患者的糞便中知名益生菌L. lactis、L. mucosae、B. adolescentis、B. breve、B. longum、S. salivarius、F. prausnitzii和A. muciniphila的水平發現，與健康人相比，UC患者中B. adolescentis、B. breve、B. longum和A. muciniphila的水平下降，但L. lactis和S. salivarius的水平增加，而L. mutice和F. prausnitzii沒有差異。此外，GMrepo 數據庫顯示，與健康人相比，IBD患者的A. muciniphila糞便豐度顯著降低。這些數據表明A. muciniphila與臨床結腸炎之間可能存在關系。
圖 A. muciniphila在UC患者中的豐度降低
圖 A. muciniphila減輕DSS誘導的急性結腸炎的表型
A. muciniphila減輕DSS誘導的急性結腸炎的表型
基于GMrepo數據庫的結果，該研究假設A. muciniphila與結腸炎的發生和發展有關。在小鼠實驗中發現，灌胃喂養A. muciniphila的小鼠（DSS-Akk組）比PBS對照組（DSS-PBS組）的體重減輕更少。與DSS-PBS組相比，DSS- Akk組的結腸縮短和腸道炎癥（結腸重量與長度之比）降低，在脾臟重量中也觀察到相同的趨勢。此外，結腸蘇木精和伊紅（H&E）染色的組織學檢查炎癥嚴重程度、炎癥浸潤和隱窩損傷顯示，A. muciniphila組的組織學評分降低。這些結果表明A. muciniphila改善了DSS誘導的急性結腸炎的表型。
NLRP3激活涉及A. muciniphila對結腸炎的保護作用
為研究A. muciniphila在DSS誘導的結腸炎中對結腸上皮屏障的影響，該研究使用阿爾新藍和過碘酸希夫反應（PAS）染色研究杯狀細胞的密度。結果發現，A. muciniphila與對照組相比增加了杯狀細胞的豐度，結果與表型一致。粘蛋白是構成腸道屏障的關鍵成分，因此研究了該模型中Muc2和Muc3的表達水平。與對照組相比，A. muciniphila組中Muc2和Muc3的表達水平升高。為了確定A. muciniphila是否影響結腸組織中的炎癥反應，檢查腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的mRNA水平發現，與PBS組相比，在A. muciniphila組結腸組織中有減少的趨勢。這些結果表明A. muciniphila誘導的腸道屏障增強和炎性細胞因子停滯有助于結腸炎的恢復。
根據上述結果，A. muciniphila對小鼠結腸炎具有保護作用，但其潛在機制尚未闡明。NLRP3 與結腸炎之間的相關性已經有很多研究，NLRP3是病原體識別、宿主免疫和炎癥的重要中樞調節劑，在人類疾病中尤為重要。在該研究中觀察到用A. muciniphila處理的小鼠結腸組織中NLRP3的mRNA和蛋白質表達上調。NLRP3介導caspase-1的激活以及隨后成熟IL-1β的釋放。因此，評估NLRP3下游分子、caspase-1 p20和成熟的IL-1β p17的蛋白質表達發現，caspase-1 p20和IL-1β p17在A. muciniphila處理后上調。這些數據表明NLRP3激活涉及A. muciniphila對結腸炎的保護作用。
圖 NLRP3激活涉及A. muciniphila對結腸炎的保護作用
圖 A. muciniphila豐度與結腸炎中NLRP3的表達相關
A. muciniphila豐度與結腸炎中NLRP3的表達相關
為確定A. muciniphila、NLRP3和結腸炎之間是否存在相關性，研究了NLRP3與人類UC之間的關系。計算來自兩個基因表達綜合（GEO）隊列（RNA-seq來自健康和潰瘍性結腸炎患者；GEO編號GSE75214，正常對照[NC] = 20，UC = 135；GEO編號GSE48959，NC = 8, UC = 7）的差異表達基因（DEGs），并繪制成一個分層聚類熱圖。此外，提取箱線圖以驗證UC患者和正常對照中NLRP3的表達水平。為進一步驗證A. muciniphila與結腸炎中NLRP3表達之間的關系，該研究測試NLRP3在DSS誘導的結腸炎模型中的表達。免疫組織化學染色顯示，用A. muciniphila處理的小鼠比PBS對照組具有更高的NLRP3表達。此外，根據A. muciniphila的組織豐度將UC患者分為低A. muciniphila和高A. muciniphila兩組。計算患者特征包括性別、年齡、體型和煙酒消費量，以確保兩組數據的可比性。免疫組織化學分析發現，高水平A. muciniphila組的NLPR3表達高于低水平A. muciniphila組。這些結果表明NLRP3在UC患者中上調，并且在結腸炎中A. muciniphila豐度與NLRP3表達之間存在正相關。
A. muciniphila在體外增加NLRP3的表達
NLRP3已被證明與小鼠和人類結腸炎中A. muciniphila的豐度有關。在UC疾病的活動期，NLRP3在固有層的免疫細胞中表達，而在上皮細胞中不存在。為確定A. muciniphila能否在體外促進NLRP3表達，使用小鼠巨噬細胞系Raw264.7細胞和小鼠骨髓源性巨噬細胞（BMDMs）來評估A. muciniphila對NLRP3激活和促炎細胞因子的產生的作用。結果顯示，Raw264.7細胞用脂多糖（LPS，500 ng/ml）處理12 h后NLRP3、IL-1β、MCP-1、IL-6和IL-10的mRNA表達顯著上升。與單獨使用LPS組相比，Raw264.7細胞與A. muciniphila（100:1）和 LPS（500 ng/ml）共培養后NLRP3、IL-1β、MCP-1、IL-10和IL-6顯著增加。在BMDM細胞中證實了類似的結果。此外，與LPS單獨組相比，LPS和A. muciniphila共培養6小時和24小時后NLRP3的蛋白質水平顯著增加。這些結果表明A. muciniphila在體外誘導NLRP3和促炎細胞因子的表達。
圖 A. muciniphila在體外增加NLRP3的表達
圖 NLRP3缺失消除A. muciniphila在結腸炎中的保護作用
NLRP3缺失消除了A. muciniphila在結腸炎中的保護作用
為了闡明A. muciniphila在結腸炎中的保護作用是否取決于NLRP3，該研究進行了NLRP3缺陷檢測。對野生型（WT）和NLRP3敲除小鼠（NLRP3-/-）進行管飼喂養，在有或沒有A. muciniphila治療后進行DSS處理。結果發現，補充A. muciniphila的小鼠減輕了結腸炎癥狀，如體重減輕、緩解結腸長度縮短和脾臟重量減少。正如預期的那樣，與A. muciniphila治療的野生型小鼠相比，灌胃喂養A. muciniphila的 NLRP3-/-小鼠在體重減輕、結腸長度縮短和脾臟重量方面顯示出增加的趨勢。與癥狀一致，當將A. muciniphila組與PBS對照組進行比較時發現，H&E染色顯示A. muciniphila組絨毛上皮的廣泛破壞、隱窩消失和炎癥細胞浸潤較少。同時，管飼法喂養A. muciniphila的NLRP3-/-小鼠與管飼法喂養A. muciniphila的野生型小鼠的相比其組織學評分增加。此外，阿爾新藍和PAS染色也出現相同趨勢。綜上所述，這些結果表明A. muciniphila在結腸炎中的治療效果取決于NLRP3。
研究結論
該研究發現，與GMrepo數據庫中的健康人相比，UC患者糞便中A. muciniphila的水平降低。口服給藥A. muciniphila BAA-835菌株顯著改善了DSS誘導的急性結腸炎的癥狀，表現為體重減輕、緩解結腸長度縮短、結腸組織學炎癥評分降低。此外，A. muciniphila處理后杯狀細胞和粘蛋白家族的數量增加，TNF-α、IL-6和MCP-1等促炎細胞因子呈下降趨勢。從機制上講，A. muciniphila處理的小鼠中NLRP3、caspase-1 p20和IL-1β p17的表達在上調。此外，高水平A. muciniphila UC患者結腸組織的NLRP3表達高于低A. muciniphila UC患者。在體外細胞實驗中，與A. muciniphila孵育后，在小鼠巨噬細胞Raw264.7細胞和BMDM細胞中觀察到NLRP3的上調。在NLRP3-/-小鼠體內進行NLRP3缺陷檢測表明，NLRP3缺失消除了A. muciniphila在急性結腸炎中的保護作用。總之，口服A. muciniphila BAA-835菌株能通過激活NLRP3減輕DSS誘導的急性結腸炎，該研究豐富了機制，為基于益生菌的結腸炎治療提供了新的前景，這將促進對A. muciniphila復雜特征的更深入了解，并為未來人類結腸炎的治療提供指導。
研究報告原文詳見：
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