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AKK菌豐度與瘦型T2D患者的胰島素分泌和葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損有關(guān)！
2021-12-17
關(guān)鍵詞；AKK菌
隨著人們的生活水平越來越高，許多人日益肥胖，肥胖是多種慢性疾病的基礎(chǔ)，尤其與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的全球流行性疾病。
其中，Ⅱ型糖尿?。?span style="font-family:Times New Roman">T2D）是一種具有不同表現(xiàn)和并發(fā)癥風(fēng)險的復(fù)雜疾病。雖然肥胖和超重是Ⅱ型糖尿病發(fā)展的主要誘因 ，但也有一部分患者體型偏瘦或體重正常。與肥胖型T2D患者相比，瘦型T2D患者具有不同的臨床特征和糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險。
越來越多科研人員對T2D潛在因素的研究集中在腸道微生物組上，與不患有T2D的人相比，T2D患者的宏基因組往往在組成和功能上都有區(qū)別。然而，腸道微生物群的改變是否以及如何在功能上影響瘦型和肥胖型T2D之間的不同臨床特征仍然不清楚。
該研究對182名健康和新診斷的T2D的瘦弱和腹部肥胖個體進(jìn)行宏基因組學(xué)和靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)AKK菌豐度在瘦型T2D患者中顯著降低，其豐度與血清3β-鵝去氧膽酸（β CDCA）水平呈負(fù)相關(guān)，與胰島素分泌和成纖維細(xì)胞生長因子15/19（FGF15/19） 濃度呈正相關(guān)。補(bǔ)充AKK菌可以保護(hù)小鼠免受高蔗糖飲食引起的葡萄糖耐受不良。
另外，該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AKK菌豐度減少與瘦型T2D患者中胰島素分泌和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的損害有關(guān)，可通過補(bǔ)充AKK菌改善葡萄糖耐量，這表明AKK菌或許可為預(yù)防和治療糖尿病提供新方向。
研究內(nèi)容
臨床實驗
從2014年5月至2014年6月，選擇四組182名性別匹配的成年個體參與者，包括正常葡萄糖耐量-瘦組（NGT-NO，n = 52）、正常葡萄糖耐量-腹部肥胖組（NGT-O，n = 52）、新診斷T2D-瘦組（T2D-NO，n = 22）、新診斷T2D-腹部肥胖組（T2D-O，n = 56）。對所有參與者進(jìn)行了口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），所有參與者都接受了全面的身體檢查，包括常規(guī)生化血液分析和心電圖。通過統(tǒng)一的問卷調(diào)查獲得有關(guān)人口統(tǒng)計學(xué)、吸煙習(xí)慣、飲酒量、教育水平、疾病家族史、手術(shù)史以及當(dāng)前和過去藥物治療的信息。收集參與者的糞便，提取DNA在Illumina HiSeq 4000平臺上進(jìn)行鳥槍宏基因組測序，每個樣本（總n = 182）的平均測序通量約為3160萬次讀取，經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾后，每個樣本平均保留3120萬個讀數(shù)，用于下游分類分析以及從頭組裝、基因預(yù)測、功能注釋和分析。另外通過靶向代謝組學(xué)定量分析血清BA和支鏈氨基酸（BCAA）水平。
動物實驗
八周大的C57BL/6J小鼠被飼養(yǎng)在特定的無病原體、單獨通風(fēng)的籠子里，每籠5只小鼠。隨意給予水。實驗小鼠分為四組：喂食正常食物（CK）、高蔗糖（HS）飲食（含42%蔗糖[g%]）和活Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）（HS-AKK）、高蔗糖飲食和熱滅活A. muciniphila（HS-hk AKK）或者高蔗糖飲食和飲用水（HS-water），持續(xù)處理15周，每天更換飲用水。每7天測量一次體重。HS-AKK組口服2 mL含5 × 1010 CFUs/mL活A. muciniphila菌（目錄號22959，模式菌株，德國微生物菌種保藏中心DSMZ）的含有20%甘油的厭氧無菌PBS。對于HS-hk AKK組，A. muciniphila在121 °C和225 kPa壓力下加熱殺死15分鐘。15周后收集各組小鼠糞便分析微生物水平。小鼠禁食進(jìn)行體內(nèi)葡萄糖耐受試驗（GTT）、胰島素耐受試驗（ITT）和葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）。收集小鼠胰腺樣品分離胰島進(jìn)行體外測定胰島素分泌。
體外細(xì)胞實驗
小鼠胰腺β細(xì)胞系MIN6用于研究3β-鵝去氧膽酸（β CDCA）對胰島素分泌的影響。細(xì)胞在存在或缺少0.5 μmol/L β CDCA的情況下，用2.8、8.3和15 mmol/L葡萄糖刺激MIN6細(xì)胞1小時。
人體腸道細(xì)胞系LS174T用于研究β CDCA對FGF19表達(dá)的影響。在150 μmol/L CDCA的存在下，用50、100和200 μmol/L β CDCA刺激LS174T細(xì)胞24小時。
研究結(jié)果
參與者特征
所有參與者中，在T2D-NO組和NGT-NO組之間未觀察到體重指數(shù)（BMI）、腰圍、大腿圍、內(nèi)臟脂肪面積（VFA）和皮下脂肪面積（SFA）的顯著差異。T2D-NO組和T2D-O組之間的空腹血糖（FPG）、口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）期間的2 h血糖（2hPG）和HbA1c沒有顯著差異。在四組中，T2D-NO組參與者的胰島素分泌（HOMA-% B）、第一階段胰島素釋放（1st PH）和第二階段胰島素釋放（2nd PH）的穩(wěn)態(tài)模型評估最低，表明胰島素分泌功能障礙。還發(fā)現(xiàn)T2D-NO和T2D-O組參與者的空腹成纖維細(xì)胞生長因子19（FGF19）水平顯著低于NGT-NO組。四組在文化程度、飲酒量和吸煙習(xí)慣等方面均無顯著差異。
圖 四組的總體研究設(shè)計和主要臨床數(shù)據(jù)
圖 參與者的人體測量參數(shù)和生化指標(biāo)表
四組中不同的腸道微生物組成
對所有182名參與者的糞便樣本進(jìn)行鳥槍宏基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，在健康和新診斷T2D人群以及瘦或腹部肥胖人群中，Bacteroides、Firmicutes和Proteobacteria門是所有組中最主要的門，這些門占腸道微生物組成的96%以上，其他細(xì)菌的豐度要低得多（平均低4%）。與其他三組相比，T2D-NO組Firmicutes門的相對豐度（30%）平均較高，Bacteroidetes門的相對豐度（62%）平均較低。然而，四組之間在門水平上沒有觀察到顯著差異。
分類分析后計算并比較四組間群落水平的微生物群多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T2D-NO組比T2D-O組具有更高的α多樣性。雖然基于系統(tǒng)發(fā)育的未加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示四組之間沒有明顯的分離，但在計算β多樣性時，通過加權(quán)UniFrac距離考慮物種豐度，可以捕獲T2D-NO組的不同微生物組成。這一發(fā)現(xiàn)表明，盡管所有四組的細(xì)菌集高度相似，但與其他三組相比，T2D-NO組的豐度分布可能是獨一無二的。更具體地說，T2D-NO和T2D-O組以及T2D-NO和NGT-O組之間存在顯著差異。盡管 NGT-NO和T2D-NO組之間存在分離趨勢，但在群落水平上沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。有趣的是，我們從PCoA中發(fā)現(xiàn)NGT-O和T2D-O組具有高度相似的整體腸道微生物群落特征。
根據(jù)微生物β多樣性確定T2D-NO vs NGT-O和T2D‐NO vs T2D‐O組之間的顯著差異后，研究發(fā)現(xiàn)27個菌種在兩個比較中存在顯著差異，兩個比較之間有幾個共同的菌種。盡管T2D-NO和NGT-NO對照組沒有表現(xiàn)出顯著的群落水平差異，但發(fā)現(xiàn)兩組之間的個體物種存在差異，如A. muciniphila、Parprevotella xylaniphila、Ruminococcaceae bacterium d16和Prevotella copri，表明T2D-NO 和NGT-NO組的差異在于某些微生物，而不是整個群落的大變化。
然后，該研究通過構(gòu)建微生物共豐度網(wǎng)絡(luò)研究四種不同代謝條件下的物種相互作用。雖然T2D-NO組網(wǎng)絡(luò)的大小似乎與NGT-NO組網(wǎng)絡(luò)相似，但它沒有很好地連接，在Faecalibacterium prausnitzii和Bacteroides stercoris之間只有一個關(guān)鍵的“橋梁”相互作用。為支持該猜想確定了幾個常用的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩裕缙骄疃搪窂介L度、接近中心性和聚類系數(shù)。T2D-NO組的親近中心性顯著低于NGT-NO組。與其他三組相比，T2D-O組的細(xì)菌共豐度網(wǎng)絡(luò)非常小且信息量不足。NGT-O網(wǎng)絡(luò)比NGT-NO對照組更小、更簡單，但比T2D-O組更復(fù)雜。
微生物組的功能表征
接下來進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）功能模塊比較發(fā)現(xiàn)，這四組表現(xiàn)出顯著的發(fā)散模塊富集。例如，T2D患者（T2D-NO和T2D-O組）的腸道微生物群顯示出“泛酸和CoA生物合成”、“黃酮和黃酮醇生物合成”、“氨基糖和核苷酸糖代謝”和“酪氨酸代謝”的富集。腹部肥胖患者（NGT-O和T2D-O組）的腸道微生物群顯示“泛醌和其他萜類-醌生物合成”和“托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成”的富集。然后，研究T2D-NO和NGT-NO組之間的差異微生物功能發(fā)現(xiàn)，T2D-NO組個體參與各種碳水化合物的攝取和磷酸化的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的功能潛力耗盡。T2D-NO微生物組中增加“纈氨酸、異亮氨酸生物合成”功能模塊。在三種支鏈氨基酸（BCAA）中，T2D-NO受試者的循環(huán)纈氨酸顯著高于NGT-NO受試者。亮氨酸和異亮氨酸水平在T2D-NO受試者中也有高于NGT-NO受試者。這些數(shù)據(jù)表明，T2D-NO個體的微生物群可能具有較低的碳水化合物利用能力和較高的BCAA生產(chǎn)能力。此外，與 NGT-NO微生物組相比，T2D-NO中參與碳水化合物代謝（包括“半乳糖降解”）的KEGG模塊高度富集。
圖 微生物群落多樣性和組成的比較
圖 A. muciniphila與胰島素分泌呈正相關(guān)
A. muciniphila豐度在T2D-NO中減少并與胰島素分泌呈正相關(guān)
四組參與者在體重相關(guān)指標(biāo)、胰島素敏感性和胰島素分泌方面具有不同的臨床特征。在調(diào)整年齡之前和調(diào)整后，觀察到腸道微生物種類與體重相關(guān)指標(biāo)和葡萄糖代謝之間的密切關(guān)系。益生菌A. muciniphila在T2D-NO組中顯著低于NGT-NO組，但在T2D-O和NGT-O組之間沒有顯著差異。此外，A. muciniphila與此處測量的所有胰島素分泌相關(guān)指標(biāo)（HOMA-%B、1st PH、2nd PH）呈正相關(guān)，在調(diào)整年齡后仍然顯著。此外，出現(xiàn)A. muciniphila的樣本中的三種胰島素分泌量顯著高于缺少A. muciniphila的樣本，進(jìn)一步支持了腸道中A. muciniphila與胰島素分泌之間的潛在關(guān)聯(lián)，在其他組的相關(guān)分析中未觀察到A. muciniphila和胰島素分泌之間的這種正相關(guān)，也未發(fā)現(xiàn)A. muciniphila與胰島素敏感性之間存在顯著關(guān)聯(lián)。
血漿BAs與臨床參數(shù)和A. muciniphila 的關(guān)系
為研究BA是否參與A. muciniphila影響胰島素分泌的過程，選擇每組性別和年齡相匹配的20名參與者，作為血清BA靶向代謝組學(xué)分析的亞組。亞組和總隊列的主要臨床特征如VFA、SFA、FPG和2hPG之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。在37個鑒定的血清BA中，四組中共有20個有顯著不同。這20個中確定為T2D-NO和NGT-NO組之間的5個不同級別的BAs：甘氨熊去氧膽酸、3β-鵝去氧膽酸（β CDCA）、β-熊膽酸、3β-膽酸和尿刊酸。
然后，研究確定NGT-NO和T2D-NO組的臨床參數(shù)、BA和腸道微生物組之間的Spearman's相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β CDCA與A. muciniphila的相對豐度和胰島素分泌指數(shù)1st PH和2nd PH呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步將宏基因組功能納入相關(guān)分析，以探索A. muciniphila如何影響BA代謝。值得注意的是，膽汁酸-輔酶A連接酶（BA誘導(dǎo)的操縱子，baiB）（KEGG Ortholog K15868）的一個關(guān)鍵基因的宏基因組豐度與A. muciniphila豐度呈正相關(guān)，并且在T2D-NO中低于NGT-NO組。baiB參與將初級BA鵝去氧膽酸（CDCA）轉(zhuǎn)化為鵝去氧膽酰輔酶A，后者進(jìn)一步用于下游次級BA生物合成。此外，baiB豐度與β CDCA負(fù)相關(guān)，次級BA生物合成途徑中的替代CDCA使用途徑的產(chǎn)物（KEGG ko00121）。綜上所述，T2D-NO組A. muciniphila和baiB的豐度較低，胰島素分泌減少，β CDCA較高，說明CDCA轉(zhuǎn)化為β CDCA 的次數(shù)更多，表明A. muciniphila和胰島素分泌之間的聯(lián)系可能受β CDCA水平介導(dǎo)。
圖 A. muciniphila與FGF19和膽汁酸之間的關(guān)系
圖 A. muciniphila宿主新陳代謝的影響
A. muciniphila對胰島素分泌的影響
上述分析表明，與NGT-NO患者相比，T2D瘦的參與者的A. muciniphila的相對豐度較低，并且根據(jù)HOMA-% B、1st PH和2nd PH的評估，A. muciniphila的豐度與胰島素分泌呈正相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，該研究使用高蔗糖（HS）飲食來模擬小鼠的T2D-NO，進(jìn)而檢查A. muciniphila對宿主代謝的可能影響。RT-PCR顯示，與喂食正常食物的小鼠相比，喂食HS飲食的小鼠糞便中的A. muciniphila數(shù)量顯著減少，用 5 × 1010 CFU/mL活A. muciniphila處理15周足以恢復(fù)因HS飲食而降低的水平。15周后，喂食HS飲食的小鼠（HS-water組）體重低于對照組，同時，HS飲食還導(dǎo)致葡萄糖耐量受損和葡萄糖刺激后胰島素分泌減弱。HS-AKK組小鼠體重明顯高于HS-water組小鼠，然而，HS-hk AKK組未發(fā)現(xiàn)體重增加。用活菌而不是熱滅活的A. muciniphila處理顯著改善了葡萄糖耐量。此外，研究A. muciniphila對體內(nèi)和體外胰島素分泌的影響發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)，四組之間未觀察到空腹胰島素分泌的顯著差異，A. muciniphila干預(yù)后葡萄糖刺激的胰島素分泌恢復(fù)，然而，HS-hk AKK組胰島素分泌沒有改善。在離體實驗中，與對照組中的2.8 mmol/L相比，25 mmol/L的葡萄糖濃度導(dǎo)致胰島素釋放顯著增加，而從HS-water組分離的胰島顯示胰島素釋放受損。與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一致，HS-AKK組分離的胰島顯示出葡萄糖刺激的胰島素分泌改善，而HS-hk AKK組分離的胰島不存在這種情況。四組間胰島素敏感性無顯著差異。這些結(jié)果表明，胰島素分泌明顯受損但沒有胰島素抵抗的小鼠模型表現(xiàn)出A. muciniphila數(shù)量減少，補(bǔ)充活的A. muciniphila可恢復(fù)胰島素分泌并改善葡萄糖耐量。
A. muciniphila治療減少β CDCA水平，并刺激胰島素分泌
使用小鼠進(jìn)一步研究A. muciniphila對血清BA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，27 BAs的代謝組學(xué)譜分析表明四個小鼠組間的5個BAs（豬膽酸、α-豬去氧膽酸、ω-鼠膽酸、石膽酸和β CDCA）水平存在顯著差異。與對照組相比，HS-water組的循環(huán)β CDCA水平顯著更高，并且用活的A. muciniphila治療顯著降低β CDCA水平。然而，給予熱滅活的A. muciniphila并沒有導(dǎo)致β CDCA 水平顯著降低。這些結(jié)果與觀察到的A. muciniphila豐度和βCDCA水平之間的呈負(fù)相關(guān)一致。
正如發(fā)現(xiàn)β CDCA和胰島素分泌呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步研究β CDCA對胰島素分泌的可能作用。用葡萄糖刺激小鼠胰腺β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞導(dǎo)致胰島素水平的顯著誘導(dǎo)。葡萄糖和β CDCA一起處理MIN6細(xì)胞抑制葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌。上述結(jié)果表明A. muciniphila可能通過降低腸道β CDCA水平刺激胰島素。
A. muciniphila通過抑制β CDCA增強(qiáng)FGF15/19
FGF19可通過不依賴胰島素的途徑刺激糖原合成并抑制糖異生。臨床分析表明，與NGT-NO 組相比，T2D-NO組的血清FGF19水平顯著降低。此外，FGF19的水平與腸道菌群中A. muciniphila的豐度呈正相關(guān)，與β CDCA水平負(fù)相關(guān)。測量A. muciniphila治療的小鼠回腸中FGF15的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與正常飼料喂養(yǎng)的小鼠相比，HS飲食喂養(yǎng)的小鼠的FGF15 mRNA水平顯著降低。用活的A. muciniphila治療恢復(fù)了由HS飲食引起的FGF15水平降低。此外，HS飲食顯著降低了肝糖原含量，但在用活A. muciniphila治療后增加。通過RT-PCR分析相關(guān)基因表達(dá)水平可以確定，補(bǔ)充A. muciniphila 能減弱由HS飲食增加的糖異生作用。
為進(jìn)一步研究β CDCA是否能抑制FGF15/19的表達(dá)，在CDCA存在情況下將人上皮結(jié)腸細(xì)胞系LS174T與各種濃度的β CDCA一起培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDCA和β CDCA一起處理LS174T細(xì)胞造成FGF19 mRNA的表達(dá)水平劑量依賴性減少，表明β CDCA抑制腸道FGF15/19的表達(dá)。這些結(jié)果表明，A. muciniphila可能會，至少部分地通過限制β CDCA的可用性來增強(qiáng)FGF15/19的表達(dá)，并引起糖原合成的刺激和糖異生的抑制。
圖 A. muciniphila對FGF15/19的表達(dá)的影響
圖 A. muciniphila通過改善胰島素分泌和FGF19表達(dá)對葡萄糖代謝的擬議作用機(jī)制
研究結(jié)論
該研究對182名健康和新診斷的T2D的瘦弱和腹部肥胖個體進(jìn)行宏基因組學(xué)和靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)A. muciniphila的豐度在患有T2D的瘦個體中顯著降低，它的豐度與血清3β-鵝去氧膽酸（β CDCA）水平呈負(fù)相關(guān)，與胰島素分泌和成纖維細(xì)胞生長因子15/19（FGF15/19） 濃度呈正相關(guān)。補(bǔ)充A. muciniphila可以保護(hù)小鼠免受高蔗糖飲食引起的葡萄糖耐受不良。進(jìn)一步研究A. muciniphila對宿主代謝有益影響背后的機(jī)制表明，A. muciniphila降低了β CDCA水平，從而增加胰島素分泌和FGF15/19的表達(dá)，導(dǎo)致血糖水平降低和葡萄糖穩(wěn)態(tài)改善。此外，β CDCA 抑制胰島素分泌和 FGF15/19表達(dá)。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，A. muciniphila豐度的減少與瘦型T2D中胰島素分泌和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的損害有關(guān)，可通過A. muciniphila改善葡萄糖耐量，為預(yù)防或治療糖尿病的新治療選擇鋪平了道路。
研究報告原文詳見：
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