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世界衛(wèi)生組織指出：超重和肥胖是全球引起死亡的第五大風(fēng)險(xiǎn)。

器官間的交流對(duì)于控制和維持能量、新陳代謝和免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。此類交流中斷的表型后果是肥胖，這是全球主要的公共衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)問題之一。然而，器官間通訊在肥胖發(fā)病機(jī)制中的中心機(jī)制和作用尚未完全闡明。到目前為止，已經(jīng)有幾種治療和預(yù)防藥物用于肥胖管理，它們可以增加能量消耗，減少脂肪吸收、能量攝入和食欲。然而，這些藥物有一些副作用，如心血管、精神和胃腸道不良事件。最近，益生菌通過改善腸道菌群組成、抗定植現(xiàn)象和各種代謝物（例如短鏈脂肪酸和維生素）的產(chǎn)生來控制腸道菌群，作為預(yù)防肥胖的有益藥物受到了廣泛關(guān)注。Akkermansia muciniphila（A. muciniphila），被廣泛認(rèn)為是下一代益生菌，可以逆轉(zhuǎn)HFD引起的不良反應(yīng)。考慮到A. muciniphila對(duì)氧氣的敏感性及其在給藥過程中的功效降低，最近的研究表明使用其非活性形式或其衍生物而不是其活性形式。應(yīng)該注意的是，副益生菌（細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分）和后生元（益生菌分泌的代謝產(chǎn)物）是兩種形式的非活性益生菌，當(dāng)以足夠的量給藥時(shí)，可能對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益影響。研究表明，與活體相比，巴氏殺菌的A. muciniphila對(duì)新陳代謝有更顯著的影響，并且可以減少體重增加并增加總能量消耗。腸道微生物群與宿主的相互作用和多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是由納米級(jí)細(xì)胞外囊泡（EVs）的分泌觸發(fā)的，它可以穿過粘液層并通過循環(huán)轉(zhuǎn)移到外周組織。在這方面，許多研究報(bào)告了腸道微生物群衍生的EVs對(duì)改善幾種疾病的積極作用。然而，需要進(jìn)一步的研究來確定微生物群EVs在預(yù)防疾病中的確切機(jī)制。盡管已經(jīng)對(duì)A. muciniphila細(xì)胞、片段和蛋白質(zhì)在各種疾病模型中的影響進(jìn)行了幾項(xiàng)研究，但尚未報(bào)道A. muciniphila衍生的EVs、巴氏殺菌和活細(xì)胞的系統(tǒng)比較。因此該研究旨在使用明確定義的飲食誘導(dǎo)肥胖模型來展示活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs在預(yù)防體重增加、炎癥和脂質(zhì)代謝方面的最佳效果，另外還旨在比較活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對(duì)預(yù)防肥胖的影響。

A. muciniphila 培養(yǎng)及其EVs制備：A. muciniphila MucT（ATCC BAA-835）在基礎(chǔ)粘蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到細(xì)菌密度OD₆₀₀為1后，通過離心去除沉淀，洗滌兩次，并用厭氧PBS重新懸浮。剩余的上清液在超速離心機(jī)中以200000 g在4 °C下提取EVs 2小時(shí), 提取后分別使用掃描電子顯微鏡（SEM）和SDS-PAGE評(píng)估EVs的形態(tài)和蛋白質(zhì)的分子量。巴氏殺菌的A. muciniphila在70 °C下進(jìn)行30分鐘。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將35只8周大的雄性C57BL/6小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，隨意獲取食物和高壓滅菌水，環(huán)境：（22–24 °C、40–60%濕度和12小時(shí)光照/黑暗）。以正常飲食（ND）（A03，安全飲食，法國(guó)）適應(yīng)一周后，將小鼠隨機(jī)分成五組（n = 7），給小鼠喂食HFD（260 HF，60%的能量來自黃油 (Kcal/kg)，安全飲食，法國(guó)），并進(jìn)行五周的治療，包括：(1) ND（標(biāo)準(zhǔn)飲食+200 μl PBS）（作為對(duì)照）; (2) HFD（HFD+200 μl PBS）（作為對(duì)照）; (3) HAm（HFD+10⁹ CFU/200 μl活A. muciniphila）; (4) HPAm（HFD+10⁹ CFU/200 μl 巴氏殺菌A. muciniphila）；(5) HEV（HFD+10 μg蛋白質(zhì)/200 μl EVs）。每周測(cè)量體重并每天監(jiān)測(cè)食物。收集血液、附睪脂肪（eWAT）、肝臟和結(jié)腸組織進(jìn)行血清學(xué)和組織學(xué)分析。

選定基因表達(dá)的計(jì)算：國(guó)家生物技術(shù)信息基因表達(dá)綜合中心（GEO）用于下載基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，納入標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）小鼠喂食 HFD 4-6 周；（2）每組（即ND和HFD）的樣本數(shù)必須多于一個(gè)；（3）利用肝組織；（4）評(píng)估所有選定基因的表達(dá)。獲得一共四個(gè)數(shù)據(jù)集符合我們研究條件，用R（3.6.1版）統(tǒng)計(jì)計(jì)算環(huán)境和BioConductor（3.12 版）用于基因微陣列分析。

通過實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)腸、脂肪和肝臟中的靶基因以及糞便中的腸道微生物群豐度。

圖上 熱圖和PCA相關(guān)性顯示HFD和ND小鼠之間涉及脂肪肝的不同肝基因

圖下 活的、巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對(duì)HFD喂養(yǎng)小鼠肝臟中肝損傷相關(guān)基因的體重、病理學(xué)和表達(dá)的影響

HFD喂養(yǎng)后，肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因（例如ppar-γ和lpl）的表達(dá)上調(diào)，而angptl4的表達(dá)下調(diào)。有趣的是，所有治療都具有降低脂質(zhì)相關(guān)基因的作用。在HFD組中觀察到tgf-β的表達(dá)水平最高，而所有治療都阻止了這種上調(diào)；然而，與HAm組相比，HPAm和HEV組中tgf-β顯著下調(diào)。在喂食HFD的小鼠中，il-10的mRNA水平表達(dá)較弱，但治療可能通過高il-10水平的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。有趣的是，EVs顯示出最高的抗炎作用。總之，這些結(jié)果表明A. muciniphila可以預(yù)防HFD誘導(dǎo)的脂肪肝。

由于HFD會(huì)引起HFD喂養(yǎng)小鼠結(jié)腸形態(tài)、完整性和炎癥的改變，因此通過H&E染色和qPCR評(píng)估了結(jié)腸組織。HFD誘導(dǎo)結(jié)腸固有層和上皮炎癥細(xì)胞的局灶性浸潤(rùn)；相反，所有治療均未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。此外，HFD組的隱窩深度和粘液層厚度顯著降低，相比之下，所有治療都阻止了這些變化。

HFD通過下調(diào)zo1、ocldn和cldn-1以及增加cldn-2表達(dá)降低腸道完整性，而在所有處理后都觀察到這些基因的調(diào)節(jié)。在HEV組中觀察到zo-1和ocldn的最高增加，但在HAm組中觀察到cldn-1的最大上調(diào)。此外，在HEV和HPAm組中觀察到更多的cldn-2下調(diào)。這些結(jié)果表明，緊密連接基因的調(diào)節(jié)是所有治療抑制HFD誘導(dǎo)的腸道通透性降低的原因。

HFD上調(diào)結(jié)腸炎癥標(biāo)志物的表達(dá)，而所有治療都可以防止這些變化，這些觀察結(jié)果伴隨著上調(diào)tlr-2和il-10以及下調(diào)tlr-4和tnf-α。EVs對(duì)降低炎癥基因mRNA水平的影響最大，而活的和巴氏殺菌的A. muciniphila的tlr-2和il-10表達(dá)分別增加更多。這些發(fā)現(xiàn)表明，巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對(duì)HFD誘導(dǎo)的腸道改變的保護(hù)作用明顯更大。

為探索活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對(duì)脂質(zhì)代謝的影響，評(píng)估結(jié)腸種血管生成素樣4（Angptl4）基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HFD組結(jié)腸中angptl4的表達(dá)降低，而治療組顯著上調(diào)，其中HEV組效果更好。總之，EVs通過調(diào)節(jié)參與肥胖和能量代謝的基因?qū)︻A(yù)防肥胖產(chǎn)生了顯著影響。

圖上 活的、巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對(duì)HFD喂養(yǎng)小鼠結(jié)腸形態(tài)、完整性和炎癥的影響

圖下 活的、巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對(duì)HFD喂養(yǎng)小鼠附睪白色脂肪組織中的體重、形態(tài)、肥胖相關(guān)基因和炎癥介質(zhì)的影響

為評(píng)估活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs是否對(duì)HFD引起的脂肪功能障礙具有預(yù)防作用，通過組織病理學(xué)分析、qPCR和ELISA評(píng)估eWAT發(fā)現(xiàn)，HFD增加了脂肪細(xì)胞的大小，而所有治療都對(duì)該參數(shù)產(chǎn)生了預(yù)防作用。在HEV、HPAm和HAm組中，脂肪細(xì)胞大小減小；HEV組表現(xiàn)出與ND組相似的正常形態(tài)。此外，與其他治療相比，HFD增加了間質(zhì)組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。然而，與HPAm組相比，HAm和HEV組的炎癥減輕較少。

脂肪細(xì)胞表面積結(jié)果顯示，與其他組相比， HFD組的平均值最大（5613.71 ± 114.29 μm²）。此外，與HFD組相比， HEV (1170.19 ± 72.38 μm² )、HPAm (2349.31 ± 33.45 μm² ) 和HAm (2452.21 ± 124.36 μm² ) 組的脂肪細(xì)胞表面積分別顯著減少。

HFD組顯示出比ND喂養(yǎng)小鼠更高的eWAT重量。然而，所有治療都顯著阻止了這種體重增加，EVs對(duì)它的影響最大。這些發(fā)現(xiàn)表明A. muciniphila及其EVs通過影響eWAT重量在預(yù)防HFD引起的肥胖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

與正常小鼠相比，HFD喂養(yǎng)小鼠的eWAT中脂質(zhì)氧化基因即ppar-α的表達(dá)降低。所有治療都可以上調(diào)這種表達(dá)。然而，HPAm沒有顯示出顯著變化，EVs對(duì)它的影響最大。此外，lpl和tgf-β在HFD組中的表達(dá)明顯高于ND組。HPAm和HEV組對(duì)lpl表達(dá)的降低具有相同的作用，但 HAm對(duì)其沒有顯著影響。在所有治療組中都觀察到tgf-β的顯著下調(diào)，而EVs和活的A. muciniphila顯示出更明顯的效果。

在HFD喂養(yǎng)的小鼠中觀察到脂肪炎癥基因（包括tlr-4、il-6和tnf-a）的過表達(dá)，而治療減輕了脂肪炎癥。在所有處理中均觀察到tlr-4和tnf-α的表達(dá)降低相同，在HAm組中觀察到脂肪il-6的 mRNA水平降低最多。

此外，在HFD組中還觀察到TNF-α和IL-6水平升高，IL-10水平降低，而所有治療均防止 HFD誘導(dǎo)的脂肪炎癥。值得注意的是，巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對(duì)炎癥介質(zhì)濃度的影響最大。這些結(jié)果表明，后生元和副益生菌A. muciniphila可以預(yù)防HFD誘導(dǎo)的脂肪炎癥。

為探索A. muciniphila是否可以調(diào)節(jié)HFD介導(dǎo)的腸道微生物群失調(diào)，通過實(shí)時(shí)PCR分析16S rRNA基因靶向門和組特異性引物量化小鼠腸道中的微生物組成。與ND組相比，HFD顯著增加梭桿菌門和厚壁菌門，并減少擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門。所有治療都會(huì)影響腸道微生物群的組成，HPAm和HEV組的厚壁菌門豐度降低，而HAm組的疣微菌門豐度增加。另一方面，巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs顯著降低厚壁菌門/擬桿菌門的比率。與 ND 組相比，HFD組的γ-/ε-/α-變形菌綱、腸桿菌科和梭菌綱的豐度顯著增加，而瘤胃球菌科的豐度顯著降低。五周后，HPAm組的α-變形菌綱、HAm和HEV組的γ-變形菌綱、HPAm和HEV組的普雷沃菌科和HEV組的梭菌綱顯著下降。在屬水平上，HFD組的腸道微生物群中羅氏菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬和大腸桿菌水平最高，而韋榮氏球菌屬、另枝菌屬、雙歧桿菌屬、甲烷短桿菌屬和A. muciniphila的水平最低。有趣的是，活的A. muciniphila在預(yù)防這些HFD引起的生態(tài)失調(diào)方面最有效，伴隨著另枝菌屬和A. muciniphila的增加，以及羅氏菌屬和大腸桿菌的減少。巴氏殺菌的A. muciniphila也顯著降低了羅氏菌屬的豐度。總體而言，A. muciniphila可以通過減少與肥胖相關(guān)的致病菌和增加與健康相關(guān)的腸道微生物群來避免HFD引起的生態(tài)失調(diào)。

圖 活的、巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對(duì)腸道微生物群模式的影響

腸道菌群與肥胖相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性表明，厚壁菌門與脂肪IL-10水平和結(jié)腸il-10表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與肝臟tgf-β表達(dá)呈正相關(guān)。擬桿菌屬水平與eWAT重量、脂肪TNF-α和IL6水平、脂肪lpl和結(jié)腸tlr-4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。體重與梭桿菌綱豐度呈負(fù)相關(guān)，在HFD組中梭桿菌綱的相對(duì)豐度最高。疣微菌門豐度與脂肪il-6 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。除了肝臟重量，結(jié)腸tnf-α mRNA水平與腸桿菌科和乳桿菌屬的豐度呈顯著正相關(guān)，而這些細(xì)菌的豐度與血漿IL-10水平呈負(fù)相關(guān)。此外，梭菌綱豐度與脂肪tlr-4 mRNA水平呈正相關(guān)，而A. muciniphila與eWAT中il-6表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。ALT與病原菌呈正相關(guān)，例如羅氏菌屬和α-變形菌綱。這些發(fā)現(xiàn)表明，施用A. muciniphila可以通過影響HFD誘導(dǎo)的腸道生態(tài)失調(diào)，在調(diào)節(jié)宿主反應(yīng)中發(fā)揮有益作用。