關鍵詞：AKK菌、AKK菌與流感病毒、AKK菌格林汁

近期的《免疫學》（Immunity）雜志上的一項研究表明：患者在接種流感疫苗后對流感疫苗產生了免疫反應導致疫苗失效的一個重要原因可能是腸道細菌。

研究背景

    流感是由流感病毒引起的全球性傳染病，并且流感病毒具有高度變異性，可以不斷重組形成新的亞型，對人類和動物具有高致病性。2013年3月出現的新型禽源性流感A（H7N9）病毒，截至2020年5月已感染1,568例人類病例，造成616例死亡。大量研究證實流感的致病性與腸道微生物群之間具有密切關系，流感感染可以改變腸道微生物群的結構，腸道微生物群的變化也會明顯影響流感感染的結果，但是這些關聯背后的細節仍有待確定，尤其是關于新出現的流感病毒（如H7N9）與腸道微生物群之間的關系。該研究通過對H7N9感染小鼠的糞便微生物進行16S rRNA測序，分析H7N9感染對小鼠腸道微生物群的影響，并闡明這些影響的可能機制。

研究內容

感染小鼠的糞便微生物分析

     12只雌性C57BL/6小鼠（8周齡）隨機分為NC組（陰性對照，使用PBS模擬感染）和H7N9感染組（n=6只小鼠/組）。將含有氯胺酮和甲苯噻嗪（分別為100和5 mg/kg）的100μL無菌PBS混合液腹腔注射麻醉小鼠后，每只小鼠鼻內接種 1×10⁴ EID₅₀ H7N9流感病毒（流感病毒 A/chick/Guangxi/YL01/2017）或等體積的PBS。感染后第0天和第7天收集糞便樣本用于后續的總DNA提取和測序。

小鼠抗生素處理

    含有氨芐青霉素（1 g/L）、萬古霉素（0.25 g/L）、硫酸新霉素（1 g/L）和鏈霉素（5 g/L）的抗生素溶液（ATB）添加到小鼠的無菌飲用水中，持續處理3天。Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835（A.muciniphila）灌胃前1天停止ATB處理。

口服灌胃A.muciniphila與小鼠感染

         30只ATB預處理的小鼠被隨機分配到三組（n=10只小鼠/組）：PBS組、A.muciniphila組和巴氏殺菌A.muciniphila組。每只小鼠每天口服200 μL PBS或200 μL含有1×10⁸ CFU的活的或巴氏殺菌的A.muciniphila的PBS。8天后，所有小鼠鼻內接種H7N9流感病毒（每只小鼠1×10⁴ EID₅₀）。每天監測小鼠的存活率和體重，持續 15 天（感染后0-14天）。

    另63只ATB預處理的小鼠被隨機分配到三組（n=21只小鼠/組）：PBS組、A.muciniphila組和巴氏殺菌A.muciniphila組。灌胃和H7N9病毒感染步驟同上。感染后第0、3、5天采集小鼠肺和血液（每組每個時間點n =5）測定肺病毒滴度和細胞因子濃度。感染后第0天和第6天處死每組額外的小鼠（每個時間點n = 3），收集肺用于組織病理學分析。

    探索A.muciniphila對感染PR8（甲型流感病毒/波多黎各/8/1934，H1N1）流感病毒小鼠的影響，21只ATB預處理的小鼠隨機分配到三組（n = 7只小鼠/組）：PBS、A.muciniphila或巴氏殺菌A.muciniphila組。灌胃步驟同上，8天后，每只小鼠鼻內接種1×10³ TCID₅₀的PR8流感病毒。每天監測小鼠的存活率和體重，持續15天（感染后0-14天）。

    研究LPS（從大腸桿菌中分離的脂多糖）對流感感染的影響，21只ATB預處理的小鼠隨機分配到三組（n=7只小鼠/組）：PBS（每天口服200 μL PBS）、LPS（每天口服200 μL含與1×10⁸ CFU巴氏殺菌A.muciniphila同劑量的LPS）或巴氏殺菌A. muciniphila（每天口服200 μL含1×10⁸ CFU巴氏殺菌A.muciniphila的PBS）組。8天后，每只小鼠鼻內接種1×10⁴ EID₅₀ H7N9流感病毒。每天監測小鼠的存活率和體重，持續15天（感染后0-14天）。

口服灌胃Lactobacillus gasseri ATCC 33323（L.gasseri）與小鼠感染

        14只ATB預處理的小鼠被隨機分配到兩組（n=7只小鼠/組）：PBS組和L.gasseri組。每只小鼠每天口服200 μL PBS或200 μL含有1×10⁸ CFU L.gasseri的PBS。8天后，所有小鼠鼻內接種H7N9流感病毒（每只小鼠1×10⁴ EID₅₀）。每天監測小鼠的存活率和體重，持續 15 天（感染后0-14天）。

流感特異性抗體反應的測量

    8只小鼠分為PBS灌胃和巴氏殺菌A.muciniphila灌胃組（n =4/組），灌胃步驟同上，每只小鼠鼻內接種5×10² EID₅₀ H7N9流感病毒（非致死劑量）。感染后14天和21天收集所有小鼠血樣通過ELISA測量血清中的流感特異性抗體。

研究結果

H7N9流感病毒感染顯著改變小鼠腸道微生物群的組成

    通過16S rRNA測序分析模擬感染小鼠（NC組）和H7N9感染小鼠（H7N9組）的糞便微生物，將所有樣本的有效標簽與具有97%相似性的OTU（操作分類單元）聚類，并對OTU的代表性序列進行物種注釋。基于ANOSIM測試發現，H7N9感染后7天的糞便微生物組成不僅與感染前的糞便相比有變化，而且與NC組的糞便相比也顯示出明顯的變化。同時，PCoA圖和UPGMA分析也表明H7N9感染組小鼠在感染后7天的糞便微生物組與其他組不同。

圖上 H7N9流感病毒感染顯著改變小鼠腸道微生物群的組成

圖下 H7N9感染小鼠和健康對照在門和屬水平的糞便微生物群豐度

A.muciniphila和L.gasseri受H7N9感染調節

    在門和屬水平上分析與H7N9感染相關的腸道微生物特征的變化，結果發現，在門水平上H7N9感染導致Proteobacteria和Verrucomicrobia的豐度更高，而Bacteroidetes的豐度更低。此外，在屬水平上H7N9感染組Akkermansia、Ruminococcus 1、Ruminococcaceae UCG-010、[Eubacterium] ruminantium group、Stenotrophomonas等的豐度較其他組顯著增加。相比之下，H7N9感染組中Rikenellaceae RC9 gut group、Lachnoclostridium、Tyzzerella等的豐度下降。

    使用線性判別分析 (LDA) 效應大小 (LEfSe) 方法分析未感染和H7N9感染小鼠的糞便微生物發現，H7N9感染組中A.muciniphila富集，并且有較少的L.gasseri，表明這兩種細菌受H7N9感染調節。

圖上 LEfSe鑒定的H7N9感染小鼠和健康對照之間具有不同豐度的分類群

圖下 口服A.muciniphila改善小鼠H7N9感染的癥狀

口服A.muciniphila改善H7N9感染的臨床癥狀

15天的小鼠的存活率和體重監測發現，口服A.muciniphila和巴氏殺菌A.muciniphila可提高小鼠的存活率，緩解小鼠體重下降。然而，針對H7N9感染巴氏殺菌的A.muciniphila比活的A.muciniphila具有更好的保護作用。LPS試驗表明，口服灌胃LPS的感染小鼠的存活率和體重下降與PBS組幾乎相同，消除了LPS的影響。此外，口服灌胃L.gasseri對感染小鼠的影響試驗發現，灌胃L.gasseri既沒有提高存活率，也沒有緩解受感染小鼠的體重下降。這些發現證明A.muciniphila中觀察到的影響實際上是特定于該屬的，并為A.muciniphila作為抗流感益生菌的潛力提供進一步的證據。

口服巴氏殺菌A.muciniphila抑制體內H7N9病毒的增殖并改善肺部病理

qRT-PCR分析小鼠肺中病毒核蛋白 (NP) 的mRNA水平，結果表明，口服活的或經巴氏消毒的A.muciniphila處理在感染后第5天肺中NP mRNA的表達顯著降低。其次，通過接種10日齡SPF雞胚檢測肺中的病毒滴度發現，同樣地，在感染后第5天，用活的或巴氏殺菌的A.muciniphila處理的小鼠的肺病毒滴度顯著低于僅用PBS處理的小鼠的肺病毒滴度。此外，通過蘇木精和伊紅染色進行肺組織病理學分析口服A.muciniphila對H7N9感染的肺部病理發現，與A.muciniphila組和巴氏殺菌A.muciniphila組相比，PBS組的肺表現出更嚴重的炎癥細胞浸潤、肺泡萎縮和纖維化。

圖上 口服A.muciniphila抑制體內H7N9病毒的增殖并改善肺部病理

圖下 口服A.muciniphila顯著改善H7N9感染小鼠肺部的免疫反應

口服巴氏殺菌A.muciniphila顯著改善H7N9感染肺的免疫反應

    通過ELISA測量肺中IFN-β、IFN-γ、IL-1β、IL-10和TNF-α的濃度評估A.muciniphila口服給藥誘導的細胞因子反應，結果顯示，與PBS組相比，活的A.muciniphila或巴氏殺菌的A.muciniphila組在感染后3天或5天小鼠肺內IFN-β、IFN-γ和IL-10水平顯著升高。相比之下，肺中的IL-1β和 IL-6在感染后5天顯著降低。數據表明，在巴氏消毒A.muciniphila的小鼠肺中IL-6水平較低，IFN-β水平較高。還發現在感染后5天，口服巴氏殺菌A.muciniphila的小鼠血液中IL-6的水平顯著降低。此外，與其他兩組相比，巴氏殺菌后的A.muciniphila小鼠血液中TNF-α水平顯著下調。雖然活的A.muciniphila或巴氏殺菌的A.muciniphila組的血清中IL-1β水平沒有變化，但其他細胞因子（IFN-β、IFN-γ和IL-10）水平顯著增加，這與肺中的細胞因子水平變化大體一致。此外，在感染后14天和21天檢測小鼠血清中流感特異性IgG的滴度發現，PBS組和巴氏殺菌A.muciniphila組之間的流感特異性IgG水平沒有差異。這些結果表明，A.muciniphila的口服給藥可以提高對H7N9感染的先天免疫反應，A.muciniphila的抗流感作用取決于其抗炎和免疫調節能力。

總結

    該研究描述了與高致病性H7N9流感病毒感染相關的腸道微生物群的改變，更重要的是發現腸道A.muciniphila與流感病毒感染之間存在正相關關系，并進一步證明口服A.muciniphila可以提高宿主對流感病毒的防御，且巴氏殺菌的A.muciniphila對H7N9流感感染具有更好的保護作用。此外，數據表明A.muciniphila的抗流感作用是由于其抗炎和免疫調節特性。該研究不僅豐富了目前關于特定腸道細菌菌株如何預防流感感染的知識，而且還鑒定了一種新型抗流感微生物，從而為抗流感益生菌的開發奠定了基礎。