關(guān)鍵詞：AKK菌、AKK菌格林汁、肝損傷

非酒精性脂肪性肝病是當(dāng)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新挑戰(zhàn)，近期內(nèi)非酒精性脂肪性肝病對人類健康的危害仍將不斷增加。

非酒精性脂肪性肝病除可直接導(dǎo)致失代償期肝硬化、肝細(xì)胞癌和移植肝復(fù)發(fā)外，還可影響其他慢性肝病的進(jìn)展，并參與2型糖尿病和動脈粥樣硬化的發(fā)病。代謝綜合征相關(guān)惡性腫瘤、動脈硬化性心腦血管疾病以及肝硬化為影響非酒精性脂肪性肝病患者生活質(zhì)量和預(yù)期壽命的重要因素。

研究背景

全世界每年的死亡原因中有2-4%的人是肝病。非酒精性脂肪性肝?。?/span>NAFLD）是最常見的肝臟疾病，全球患病率為25%。它是晚期肝纖維化、肝細(xì)胞癌（HCC）和肝功能衰竭的主要原因。正常肝組織由5-10%的靜止肝星狀細(xì)胞（HSC）組成，它們是位于肝竇周間隙的非實質(zhì)細(xì)胞。纖維化標(biāo)志物的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的過度積累導(dǎo)致HSC活化，進(jìn)一步導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。炎癥通過相鄰的庫普弗細(xì)胞細(xì)胞分泌細(xì)胞因子在觸發(fā)HSC激活中起重要作用。腸道微生物通過維持代謝和免疫穩(wěn)態(tài)以及抵御病原體影響宿主的健康狀況。腸道因腸-肝軸與肝臟之間存在雙邊聯(lián)系。最近的證據(jù)表明，腸道微生物群組成的變化與各種肝病的許多病理狀況有關(guān)。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群組成可能是預(yù)防肝損傷的一種潛在方法。研究已揭示Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）作為下一代有益微生物在喂食高脂肪飲食（HFD）的小鼠的代謝和免疫功能中的保護(hù)和調(diào)節(jié)作用。此外，源自腸道微生物群的細(xì)胞外囊泡（EVs）可以通過滲透到循環(huán)系統(tǒng)中傳播到各個器官，并導(dǎo)致廣泛的免疫反應(yīng)。該研究課題組前期發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)A. muciniphila及其EVs通過增加白色脂肪細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）基因的mRNA水平并誘導(dǎo)結(jié)腸組織中的免疫止血，對HFD喂養(yǎng)的小鼠具有抗肥胖作用。此外，在2021年發(fā)現(xiàn)熱滅活的A. muciniphila可以抑制HSC活化并誘導(dǎo)脂多糖（LPS）激活的LX-2細(xì)胞系中的HSC退化。因此，該研究旨在靜止和LPS激活的LX-2細(xì)胞系中檢查了HSC對活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs的反應(yīng)，此外還評估了活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs在HFD/四氯化碳（CCl₄）引起的肝損傷小鼠模型中的效果。

研究內(nèi)容

細(xì)菌培養(yǎng)、巴氏殺菌和EVs提取

A. muciniphila MucT 菌株（ATCC BAA-835）培養(yǎng)后離心，用無菌厭氧PBS洗滌沉淀兩次，用于進(jìn)一步的共培養(yǎng)實驗和小鼠實驗。部分細(xì)菌懸浮液在70 °C下加熱15分鐘以制備巴氏殺菌細(xì)菌。細(xì)菌培養(yǎng)上清液進(jìn)行超速離心提取 EVs。

LX-2活化和治療

來自大腸桿菌0111:B4的脂多糖（LPS）以0.01 μg/ml的濃度使用6小時，激活LX-2細(xì)胞系。之后，未刺激的LX-2和LPS激活的細(xì)胞接種不同的感染復(fù)數(shù)（MOIs 1，10，100）的活的（Lam）、巴氏殺菌（Pam）的A. muciniphila和不同濃度（1，10，50 μg/ml）的EVs，在 37 °C的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。從LX-2細(xì)胞中提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR分析GAPDH作為參考基因。

動物實驗

25只雄性野生型C57BL/6小鼠（8周齡）在12小時光照、22–23 °C和40%濕度條件下進(jìn)行馴化，自由獲取標(biāo)準(zhǔn)飲食（SD）和高壓滅菌水。使用CCl₄伴隨高脂肪飲食誘導(dǎo)肝損傷，HFD 動物腹腔注射2 ml/kg體重的10% CCl₄ 橄欖油溶液，每周兩次，持續(xù)4周。將小鼠隨機(jī)分組（n ?= 5），健康對照（動物在沒有干預(yù)的情況下接受SD）、載體（HFD/CCL₄ + 200 μl 無菌 PBS）、Lam（HFD/CCL₄ ?+ 10⁹ CFU/200 μl 活A. muciniphila），Pam（HFD/CCL₄ ?+ 10⁹  CFU/200 μl 巴氏殺菌A. muciniphila ) 和 EVs（HFD/CCL₄?+ 50 μg 蛋白質(zhì)/200 μl），通過每日口服管飼法給予4周。處理結(jié)束時，頸椎脫臼處死小鼠，收集肝臟和結(jié)腸組織用于組織病理學(xué)和組織學(xué)分析，在沒有事先禁食的情況下采集血樣進(jìn)行血清轉(zhuǎn)氨酶和肝細(xì)胞因子的測定。收集肝臟、結(jié)腸和白色脂肪組織進(jìn)行qRT-PCR分析以評估靶基因的相對表達(dá)，rpl -19作為標(biāo)準(zhǔn)化基因。

研究結(jié)果

A. muciniphila減弱LPS激活的LX-2細(xì)胞中tlr -5和tlr -9的mRNA水平

為評估A. muciniphila及其衍生物對tlr -5和tlr -9基因mRNA水平的影響，該研究使用不同的MOIs（1、10和100）和 EVs濃度（1、10和50 μg）處理靜止和LPS激活的LX-2細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理的對照細(xì)胞相比，活細(xì)胞和巴氏殺菌處理均未改變靜止的LX-2細(xì)胞中tlr-5和tlr -9基因的表達(dá)，而50 μg的EV對tlr -5的表達(dá)具有抑制作用。在LPS刺激的LX-2細(xì)胞中，也僅有50 μg的EV可顯著降低tlr -5基因的mRNA水平。在LPS激活的LX-2細(xì)胞中，所有濃度的EV都能顯著下調(diào)tlr -9基因，而在MOI 1和MOI 10時的Lam以及MOI1處的Pam可以降低tlr -9基因的表達(dá)。因此，盡管所有處理對活化的LX-2細(xì)胞中tlr -5和tlr -9基因的mRNA水平都有抑制作用，但EVs的作用更為明顯，對靜止細(xì)胞幾乎沒有觀察到顯著影響。

圖上 動物實驗的研究設(shè)計；LX-2細(xì)胞系中所有A. muciniphila補充劑的抗炎作用

圖下 LX-2細(xì)胞系中所有A. muciniphila補充劑的抗炎作用

A. muciniphila顯著上調(diào)LX-2細(xì)胞中的PPARs基因表達(dá)

該研究還在靜止和LPS刺激的LX-2細(xì)胞中評估了活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其 EV對抗炎因子ppar-α和ppar-γ基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在靜止細(xì)胞中，用不同的活的和巴氏殺菌的細(xì)菌MOIs和EV濃度處理并沒有顯著改變ppar-α和ppar-γ基因的表達(dá)，而 50 μg的EV能夠顯著增加ppar-α和ppar-γ的mRNA水平。在LPS激活的細(xì)胞中，與未處理對照細(xì)胞相比，不同處理組的ppar-α基因的mRNA水平被顯著誘導(dǎo)。其中，三種MOI和濃度下的Lam和EV以及MOI 10和100下的Pam對ppar-α基因的誘導(dǎo)有顯著影響。然而，在LPS激活的LX-2細(xì)胞中，與未處理的對照細(xì)胞相比，不同處理顯著誘導(dǎo)ppar-γ的mRNA 水平，其中細(xì)菌MOI 10和50 μg EV對ppar-γ基因的誘導(dǎo)有顯著影響。因此，幾乎所有治療都能夠誘導(dǎo)ppar-α和ppar-γ基因的表達(dá)，盡管在EV治療中以劑量依賴性方式觀察到最佳效果。

A. muciniphila及其衍生物可以通過調(diào)節(jié)炎癥來維持腸道穩(wěn)態(tài)

組織學(xué)分析顯示，PBS組結(jié)腸黏膜有炎癥細(xì)胞浸潤（2級）。與SD組（16.7±0.37 μm）相比，PBS組（11.92±1.64 μm）上皮細(xì)胞厚度顯著減少。PBS組黏膜層厚度（92.58±7.8 μm）明顯低于SD組（119.95±1.97 μm）。Pam組黏膜層（161.45 ± 14.5 μm）和上皮（21.05 ± 1.25 μm）細(xì)胞厚度最大。此外，與PBS組相比，Lam和EV組的黏膜層和上皮細(xì)胞厚度顯著增加。與PBS組相比，EV（119.9±3.1 μm）、Pam（148.9±1.8 μm）和Lam（135.1±3.2 μm）組的隱窩深度顯著增加。與SD組（116.8 ± 1.6 μm）相比，Pam和Lam組的隱窩深度顯著增加。與所有組相比，PBS組（86.9±1.6μm）的結(jié)腸隱窩深度顯著降低。

圖上 不同研究組中結(jié)腸的組織學(xué)分析

圖下 活的和巴氏殺菌的A. muciniphila給藥對不同研究組中肝臟的組織學(xué)分析

通過使用組織病理學(xué)評分系統(tǒng)對小鼠結(jié)腸組織損傷進(jìn)行評分。各組總分如下：SD組，0.42 ± 0.22；PBS組，4.25±0.14；Lam組，2.42 ± 0.22；Pam組，1.25 ± 0.14和EV組，0.58 ± 0.08。組織病理學(xué)評分的統(tǒng)計分析顯示PBS vs SD、Lam vs PBS、Pam vs PBS和EV vs PBS間有顯著差異。這些觀察結(jié)果伴隨著用活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs處理的小鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白ocldn和cldn -1的mRNA水平顯著增加，以及cldn -2的減少。盡管不同處理之間的黏膜層厚度存在顯著差異，但它們誘導(dǎo)緊密連接蛋白基因的能力是相同的。

活A. muciniphila及其EVs對HFD/CCL₄處理小鼠的肝組織具有抗炎作用

肝臟組織病理學(xué)分析證實，與SD組相比，PBS組建立了急性肝損傷。H&E染色顯示，SD組未見組織病理學(xué)改變，而PBS組肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見炎性細(xì)胞浸潤、點狀壞死、肝細(xì)胞壞死以及脂質(zhì)微泡和大泡。PBS組雙核肝細(xì)胞數(shù)較SD組顯著減少。此外，與SD組和PBS組相比，EV、Lam和Pam 組的雙核肝細(xì)胞數(shù)量顯著增加。雙核肝細(xì)胞的存在表明肝細(xì)胞再生而沒有任何其他組織病理學(xué)變化。在Pam組中，雖然在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到炎性細(xì)胞浸潤、點狀壞死、肝細(xì)胞壞死以及脂質(zhì)微泡和大泡，但也觀察到雙核肝細(xì)胞的存在，表明肝細(xì)胞再生。此外，通過使用組織病理學(xué)評分系統(tǒng)對肝組織的組織學(xué)損傷評分，各組總分如下：SD組，0.5 ± 0.14；PBS組，9.5±0.28；Lam組，1.83 ± 0.16；Pam組，6.83 ± 0.44和EV組，0.75±0.13。組織病理學(xué)評分的統(tǒng)計分析顯示PBS vs SD、Lam vs PBS、Pam vs PBS和 EV vs PBS間有顯著差異，而EV vs SD之間沒有觀察到顯著差異。

為研究活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs的抗炎作用，該研究還評估了小鼠肝組織中TNF-α、IL-6和IL-10的水平。結(jié)果顯示，與SD組相比，PBS組中IL-6、TNF-α和IL-10水平顯著增加，表明炎癥是在HFD/CCL₄處理的小鼠肝組織中誘導(dǎo)。雖然用活的A. muciniphila灌胃可以降低TNF-α水平，但這種效果沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而施用EVs可以顯著降低 TNF-α 的水平。此外，用活A. muciniphila及其EVs灌胃可顯著降低IL-6水平，而巴氏殺菌處理組的IL-6水平與PBS組相比沒有顯著變化。巴氏殺菌的A. muciniphila對TNF-α細(xì)胞因子的影響也不顯著，但顯著提高了組織中IL-10的水平。盡管口服管飼所有治療均可降低 IL-6和TNF-α的水平并增加IL-10，但這些抗炎作用在Lam和EV組中是顯著的。

圖上 活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs給藥對4周后血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響

圖下 肝臟炎癥相關(guān)基因和抗炎相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

此外，血清轉(zhuǎn)氨酶水平的評估顯示，與SD組相比，PBS組的ALT和AST水平顯著升高，表明PBS組存在肝損傷。用 Lam、Pam和EVs進(jìn)行口服管飼能夠降低研究組中ALT、AST的水平。

A. muciniphila對HFD/CCL₄處理小鼠肝組織中的炎癥基因具有抑制作用

在HFD/CCL₄小鼠模型的肝組織中，活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs通過抑制TLRs和炎性細(xì)胞因子如il-1β、il-6和抗炎因子il-10的表達(dá)來表現(xiàn)其抗炎作用。HFD/CCL₄顯著升高tlr -5和tlr- 9的mRNA水平，進(jìn)而導(dǎo)致PBS組中炎性細(xì)胞因子增加和il-10減少。與PBS組相比，給予Lam、Pam和EVs能夠顯著降低tlr-5和tlr-9基因的表達(dá)。這種細(xì)菌及其衍生物還通過降低il-1β和IL-6的表達(dá)并增加il-10來調(diào)節(jié)炎癥和抗炎細(xì)胞因子從而誘導(dǎo)肝組織中的免疫穩(wěn)態(tài)。有趣的是，各組間EV對誘導(dǎo)il-10和抑制il-1β的影響最大。

A. muciniphila通過上調(diào)PPARs基因表達(dá)對HFD/CCL₄處理小鼠的肝組織具有抗炎作用

研究活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs對肝組織中抗炎因子ppar-α、ppar-γ和igf 基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在HFD/CCL₄誘導(dǎo)肝損傷的PBS組中ppar-α、ppar-γ和igf表達(dá)顯著降低。與PBS組相比，經(jīng)口灌胃的處理能夠顯著誘導(dǎo)各組肝組織中這些抗炎因子ppar-α、ppar-γ和igf的mRNA水平，而EVs的效果比活的和巴氏殺菌的A. muciniphila更明顯，尤其是igf 和ppar-α的水平。

EVs對HFD/CCL₄處理的小鼠的白色脂肪組織具有顯著的抗炎作用

為研究活的和巴氏殺菌的A. muciniphila及其EVs的抗炎作用，評估了小鼠脂肪組織中TNF-α、IL-6和IL-10的水平。結(jié)果顯示，與SD組相比，PBS組觀察到IL-6和TNF-α的水平顯著增加，表明在脂肪組織中誘導(dǎo)了炎癥。盡管口服管飼活的和巴氏殺菌的A. muciniphila可以降低IL-6，但這種效果沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而施用EVs可以顯著降低IL-6的水平。用活的A. muciniphila及其EVs進(jìn)行口服灌胃也降低了TNF-α并增加了IL-10的水平。巴氏殺菌A. muciniphila對TNF-α和IL-6的影響并不顯著，但IL-10的水平發(fā)生顯著變化。盡管所有治療的口服管飼法均可降低IL-6和TNF-α的水平并增加IL-10，但這些抗炎作用在Lam和EV組中是顯著的。

圖 脂肪組織細(xì)胞因子水平和的脂肪組織 mRNA 水平

A. muciniphila及其EVs的抗炎作用伴隨著小鼠白色脂肪組織中ppar-α和ppar-γ的mRNA 水平的增加以及il-1β的減少。盡管活的和巴氏殺菌的A. muciniphila能夠增強ppar-α的表達(dá)，但EVs的效果更明顯。所有處理均顯著增加脂肪組織中ppar-γ和減少il-1β的表達(dá)，而HFD/CCL₄顯著下調(diào)PBS組中ppar-α和ppar-γ并上調(diào)的il-1β。

結(jié)論

施用活的和巴氏殺菌的AKK菌其EVs可改善HSC的激活。組織病理學(xué)分析顯示，在所有治療中通過增加上皮和粘膜層厚度以及加強腸道完整性，從而改善腸道健康。活的AKK菌及其EVs對肝臟炎癥和肝細(xì)胞損傷具有抑制作用。組織細(xì)胞因子的產(chǎn)生和炎癥基因表達(dá)水平表明，活的AKK菌其EVs對肝臟和脂肪組織具有更明顯的抗炎作用。此外，EVs對調(diào)節(jié)與肝臟中TLR、PPAR和免疫反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)有更好的效果。總之，目前的結(jié)果表明，可以增強結(jié)腸、脂肪和肝組織的抗炎反應(yīng)，從而預(yù)防 HFD/CCL₄造成的小鼠肝損傷。然而，該研究存在一些局限性，未能確定從AKK菌中分離出的EV的含量，因此無法解釋這些細(xì)菌衍生物在肝功能和腸道止血中的確切有益機(jī)制。需要進(jìn)一步的研究來證實AKK菌的作用及其衍生物對預(yù)防人類肝損傷的作用，并探討其潛在風(fēng)險和不良反應(yīng)。

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