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關鍵詞：AKK菌、AKK菌格林汁、肝損傷

肝臟是腹腔內最大的實質性器官，也是人體最重要的代謝和解毒器官，擔負人體的重要生理功能。

藥物是肝損害的重要病因之一。對乙酰氨基酚是最常用的非處方止痛藥，它存在于許多不同的藥物產品中如感冒、流感片劑甚至是睡眠片劑，藥店可以輕松購買到相關藥品，可這并不意味著它是安全的。事實上，對乙酰氨基酚毒性是急性肝毒性的最常見原因。如果攝取太多，它會對身體造成嚴重的損傷。新的研究表明，如果多年使用，對乙酰氨基酚會增加患某些血癌的風險。

研究背景

對乙酰氨基酚（APAP）是臨床常用的非甾體解熱鎮痛藥。然而，過量的APAP具有很強的肝毒性，是全世界急性肝損傷的主要原因。在無毒代謝途徑達到飽和后，過量的APAP經細胞色素P450（CYP）家族酶的催化生成細胞毒性化合物 N-乙酰基-對苯醌亞胺（NAPQI），并消耗肝臟中的谷胱甘肽（GSH）。當GSH耗盡時，肝細胞無法解毒NAPQI，剩余的NAPQI試圖與線粒體蛋白結合，導致氧化應激和線粒體功能障礙，最終導致肝細胞壞死。腸道微生物群與其宿主保持共生關系。越來越多的研究報告了腸道微生物群與肝臟疾病之間的重要關聯。通過促進膽汁酸循環、內毒素易位、通過Toll樣受體調節Kupffer細胞、腸源性T細胞遷移等作用，微生物群失調與肝臟疾病如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、自身免疫性肝病和肝硬化等密切相關。調節微生物結構已成為改善肝病預后的重要治療方法。盡管有報道稱微生物群介導APAP肝毒性，并且選定的物種可以防止藥物引起的肝損傷，但微生物群對APAP誘導的肝損傷的影響及其機制的研究還不夠充分。在動物研究中，只有少數益生菌被證實對APAP引起的肝損傷具有保肝作用。Akkermansia muciniphila被認為是一種非常有前途的益生菌，占人體腸道菌群的0.5%~5%，在促進免疫調節和代謝功能以及維持宿主的穩態條件方面具有代表性。A. muciniphila粘附在粘液層并消耗粘液聚糖寡糖作為營養物質。粘蛋白的降解代謝物，如短鏈脂肪酸（SCFAs），可以調節脂質代謝和免疫反應相關基因的表達。研究表明A. muciniphila給藥顯著改善了伴刀豆球蛋白A（ConA）模型中的免疫介導的肝損傷。該研究旨在探索A. muciniphila對APAP誘導的肝損傷的影響，并通過多組學整合，結合16S 測序、轉錄組學和代謝組學研究其潛在機制。

研究內容

無特定病原體（SPF）C57BL/6小鼠（雄性，6周）維持在SPF環境中。適應性喂養2周后，將小鼠隨機分為四組（每組n=10）：AkAP（A. muciniphila+APAP）、AkC（A. muciniphila+鹽水對照）、NsAP（生理鹽水+APAP）和NsC（生理鹽水+生理鹽水對照）。AkAP和AkC組的小鼠每天灌胃0.2 mL含3×10⁹ CFU A. muciniphila Muc T（ATCC BAA-835）的無菌鹽水，而NsAP和NsC組中的小鼠用等劑量的無菌鹽水處理，處理持續14天。灌胃處理14天后在第15天建立APAP誘導的肝損傷模型。在禁食12小時后，AkAP和NsAP組的小鼠腹腔注射APAP（300 mg/kg生理鹽水），而AkC和NsC組的小鼠給予等體積的生理鹽水作為對照。腹腔注射后24 h收集各組小鼠新鮮糞便，然后處死。收集血液和肝組織進行生化參數分析；收集肝組織和結腸組織進行組織學和免疫組織化學分析；流式細胞術分析新鮮肝臟，TUNEL檢測評估肝細胞的細胞凋亡；處死前收集的糞便用于16S rRNA測序，進行靶向糞便代謝組學分析；從儲存的肝片段中提取總RNA進行轉錄組測序和RT-qPCR分析；對肝樣品進行蛋白質印跡分析。所有小鼠飼養在環境溫度和濕度控制條件下，自動12小時明暗循環，并隨意提供食物和水。

研究結果

A. muciniphila改善APAP誘導的肝損傷

300 mg/kg APAP給藥后24 h建立小鼠急性肝損傷模型。作為肝功能的典型生物學標志物，測定血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）水平以評估肝損傷的嚴重程度。腹腔注射APAP后ALT和AST水平顯著升高。此外，與生理鹽水+APAP（NsAP）處理組相比，A. muciniphila（AkAP）的給藥顯著降低了ALT和AST水平。蘇木精和伊紅（H&E）染色分析顯示NsAP組有廣泛壞死和大量炎性細胞浸潤的跡象，A. muciniphila+APAP（AkAP）治療組中僅觀察到零星的小壞死灶和相對較低的炎性細胞浸潤。A. muciniphila+生理鹽水（AkC）對照組和生理鹽水+生理鹽水（NsC）對照組中未檢測到明顯的病理結果。改良組織學活性指數（HAI）與ALT和AST水平的變化呈現出相似的趨勢：與NsC相比，NsAP的HAI評分顯著增加，并且在A. muciniphila給藥后部分恢復。綜上所述，上述結果表明A. muciniphila有效地減輕了APAP誘導的肝損傷。

圖上 A. muciniphila的給藥改善APAP誘導的肝損傷和氧化應激

圖下 A. muciniphila改善APAP誘導的氧化應激和肝臟炎癥反應

A. muciniphila減輕APAP誘導的氧化應激和炎癥反應

由細胞內GSH耗竭引起的線粒體通透性增加和氧化應激被認為是APAP誘導的退化的初始但關鍵觸發因素。該研究測定GSH、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和超氧化物歧化酶（SOD）的水平以評估對氧化應激的脆弱性。APAP處理后24小時，GSH、GSH/GSSG和SOD水平顯著降低。然而，與NsAP相比，AkAP組顯示出這些指標的明顯恢復。此外，四組間的GSSG水平無顯著差異。

由活化的Kupffer細胞和浸潤的免疫細胞介導的炎癥反應在APAP毒性級聯發展中起著至關重要的作用。為評估肝臟炎癥，該研究在轉錄水平檢測了代表性炎癥標志物（IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ）的表達變化。NsAP組小鼠的IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α表達明顯低于NsC小鼠，表明APAP導致肝臟炎癥反應。然而，與NsAP相比，AkAP中A. muciniphila給藥后這些細胞因子下調表明炎癥減輕。此外，用抗F4/80或抗Ly6G進行免疫組織化學分析以估計巨噬細胞和中性粒細胞的肝浸潤。染色結果表明APAP顯著促進巨噬細胞和中性粒細胞的募集，而A. muciniphila給藥明顯減少巨噬細胞和中性粒細胞浸潤。流式細胞術分析還證實，與NsC相比，AkAP中巨噬細胞和中性粒細胞的積累增加；而與NsAP相比，AkAP的巨噬細胞和中性粒細胞數量較少。此外還觀察到其他免疫細胞亞群（CD4 ⁺ T細胞、CD8 ⁺ T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞）沒有顯著變化。這些結果表明A. muciniphila改善了APAP肝毒性誘導的氧化應激和肝臟炎癥反應。

A. muciniphila在APAP攻擊期間調節肝臟轉錄表達的改變

為進一步研究A. muciniphila如何有助于保護肝臟免受APAP引起的損傷，該研究對從AkAP、NsAP和NsC（每組n=4）采集的肝臟進行轉錄組分析。在NsAP vs NsC比較組中，通過使用P?< 0.05和| log ₂（fold change）| > 1標準鑒定出2810個差異表達基因（DEGs）。在這些DEGs中，與NsC相比，NsAP中分別有1558和1,252個顯著上調和下調。在AkAP vs NsAP比較組中，838和846個DEGs在NsAP中分別顯著上調和下調。NsAP和 NsC具有明顯不同的基因表達模式，而AkAP和NsC的聚類模式相對相似和同質，表明病理過程的改善。通過對來自兩個轉錄組比較的所有DEGs進行重疊分析，確定了777個由APAP注射促進但被A. muciniphila給藥抑制的DEGs和711個由APAP注射抑制但由A. muciniphila給藥促進的DEGs，表明A. muciniphila顯著調節了由APAP引起的轉錄改變。對來自NsAP vs NsC比較組的DEGs進行基于adj-P <0.05的京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析揭示了73條途徑。受影響的途徑主要分配給藥物代謝，涉及CYP、UGT、SULT和谷胱甘肽S -轉移酶（GST）家族。KEGG富集分析AkAP vs NsAP比較組確定了50種途徑，例如類固醇激素生物合成、細胞色素P450對異生素的代謝和細胞因子-細胞因子受體相互作用。通過映射來自這50條重要途徑的基因來構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，以對參與肝保護的基因進行分類。從PPI網絡中提取了四個主要簇，分別代表藥物代謝、炎癥、氨基酸生物合成和信號傳導。值得注意的是，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)/Akt）途徑被確定為第4組中最豐富的途徑。這些結果表明A. muciniphila的保護可歸因于與代謝、炎癥和信號相關的轉錄表達的調節轉導。

圖上 A. muciniphila干預影響肝臟轉錄組的改變

圖下 A. muciniphila干預抑制APAP誘導的細胞凋亡并激活PI3K/Akt信號通路

A. muciniphila激活PI3K/Akt通路并抑制肝臟中的細胞凋亡

轉錄組學結果表明，PI3K/Akt通路可能是導致A. muciniphila在APAP攻擊下的作用的原因。激活的PI3K/Akt通路通過調節Bcl-2和Bax來抑制細胞凋亡。APAP處理對Akt和PI3K磷酸化沒有影響，但A. muciniphila在APAP攻擊后促進了Akt和PI3K的磷酸化。Bax在NsAP組中的蛋白表達明顯高于AkAP和NsC組，AkAP組中Bcl-2的表達明顯高于NsAP，與NsC相比沒有明顯變化。作為細胞凋亡的重要指標，Bcl-2/Bax比值在NsAP中降低，而A. muciniphila傾向于將這種變化逆轉為在NsC中觀察到的水平。c-Jun N-末端激酶（JNK）和下游蛋白的激活是放大線粒體功能障礙和觸發細胞凋亡的關鍵介質。該研究還發現A. muciniphila阻止了APAP引起的ERK1/2和JNK磷酸化水平的增強，而對NF-κB的磷酸化水平沒有顯著影響。與這些發現一致，末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）測定表明，與NsAP相比，AkAP中TUNEL陽性肝細胞的百分比降低，表明A. muciniphila減少了由APAP肝毒性引起的核DNA片段化。因此，A. muciniphila促進了PI3K/Akt通路的激活，糾正了Bcl-2/Bax比率，進一步抑制了肝細胞凋亡。

A. muciniphila增強腸道屏障功能并抑制LPS刺激

腸道屏障完整性的破壞是APAP中毒的肝外特征。該研究結果表明，在NsAP中血清脂多糖（LPS）水平升高，而在AkAP中由APAP毒性引起的LPS水平升高明顯減輕。LPS被肝臟中的TLR4識別并觸發MyD88依賴性炎癥。肝臟中TLR4和MyD88的mRNA表達被APAP顯著激活，并被A. muciniphila有效抑制至正常水平，表明APAP介導的LPS泄漏和細菌易位受到限制。此外，評估幾種典型的腸道屏障因子（Occludin、Claudin、MUC2、ZO-1、大麻素受體1和大麻素受體2）的mRNA和蛋白質表達水平發現，與NsC相比，NsAP中Occludin和MUC2的mRNA表達分別下調45.8%和50.3%，并且A. muciniphila將Occludin和MUC2 mRNA表達增強至正常水平。僅在NsAP和AkC之間觀察到Occludin蛋白表達的顯著差異。MUC2蛋白表達遵循與mRNA表達相似的模式。NsAP和NsC之間的比較表明，APAP顯著降低了Claudin蛋白水平。與NsAP相比，AkAP顯示出恢復的Claudin蛋白水平。APAP沒有誘導Claudin mRNA表達減少，但A. muciniphila仍然發揮刺激作用。這些組之間的大麻素受體1、大麻素受體2和ZO-1水平沒有顯著差異。

圖左 A. muciniphila增強腸道屏障功能

圖右 A. muciniphila對APAP處理后微生物分類豐度變化的調節作用

A. muciniphila調節APAP誘導的腸道生態失調

為進一步揭示APAP過量對腸道穩態的肝外影響，該研究進行了16S rRNA測序分析，以探索APAP攻擊期間腸道微生物群組成的改變以及A. muciniphila給藥對微生物群落結構的影響。在APAP處理后，Chao1和香農指數顯示α多樣性增加。糞便樣本根據微生物區系的相似性進行聚類，并通過未加權的UniFrac主坐標分析（PCoA）說明，AkAP和NsAP的微生物組譜與NsC的微生物組譜明顯分開。微生物組的分類豐度發生了巨大變化。在門水平上，在灌胃A. muciniphila后，疣微菌門在AkAP和AkC中積累。APAP注射后，脫鐵桿菌門、藍細菌門和脫硫桿菌門的相對豐度顯著增加。在使用或不使用A. muciniphila的APAP處理后，放線菌門的富集顯著降低。與NsAP相比，AkAP中脫硫桿菌的相對豐度下降。在屬水平上，與NsC相比在NsAP中觀察到高比例的擬桿菌屬、顫桿菌屬、粘螺菌屬和大腸桿菌，杜氏乳桿菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、普雷沃氏菌科UCG-001屬和Candidatus_Saccharimonas屬的比例降低。與NsAP相比AkAP中的乳酸桿菌和Candidatus_Saccharimonas屬顯著富集，而顫桿菌屬顯著耗盡。AkAP小鼠的乳酸桿菌屬豐度明顯高于AkC小鼠。接下來在AkAP、NsAP和NsC之間進行了線性判別分析（LDA）效應大小（LEfSe）分析，以確認微生物群結構的改變并確定特征分類標記。根據NsAP和NsC的比較，APAP處理后顫桿菌屬、Mucispirillum屬、Colidextribacter屬和擬桿菌屬富集，并去除了杜氏乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、Allobaculus屬、普雷沃氏菌科UCG-001屬和乳酸桿菌屬。AkAP和NsAP的比較表明，AkAP組中乳酸桿菌、Candidatus_Saccharimonas屬和Akkermansia屬富集，而NsAP組中顫桿菌屬、 Colidextribacter屬、Pseudaminobacter屬、瘤胃梭菌屬和Idiomarina屬富集。

A. muciniphila重塑的微生物群恢復了SCFA的產生

短鏈脂肪酸僅由宿主微生物發酵產生，被認為是肝-腸軸中不可或缺的信號。因此，該研究進行了靶向代謝組學分析以確定糞便中特定SCFAs（乙酸、丙酸、2-甲基丙酸、丁酸、2-甲基丁酸和戊酸）的濃度。與NsC相比，AkC組在乙酸、丁酸和2-甲基丁酸的水平上表現出一致的增強，表明A. muciniphila引發了SCFA的產生。APAP注射與A. muciniphila給藥后，乙酸、丙酸和丁酸的濃度顯著降低，表明APAP突然降低了SCFA的產生。A. muciniphila增加了這些SCFAs的水平，盡管恢復的水平仍然低于NsC和AkC中的水平。APAP處理的小鼠顯示2-甲基丁酸和戊酸升高，但差異不顯著。即便如此，在APAP注射后A. muciniphila仍然導致這些SCFAs的濃度增加至常規水平。

圖上 A. muciniphila在APAP攻擊后提高了SCFA的產量

圖下 腸道微生物群、微生物代謝和APAP誘導的病理變化之間的相互作用

差異豐富的微生物屬和代表性生物標志物的相關性

此外，該研究進行涉及差異屬、SCFAs和損傷指標的相關性分析，以確定改變的腸道屬和生物標志物之間的假定關聯。差異豐度微生物屬與SCFAs的相關性分析表明，在Akkermansia管理下，乳酸桿菌屬和Candidatus_Saccharimonas屬是保守的，它們的相對豐度與 Akkermansia的相對豐度呈正相關。在顫桿菌屬、Mucispirillum屬和Colidextribacter屬之間發現了相應的正相關，因為這些屬被認為是不利的屬并且在NsAP組中富集。乙酸與杜氏乳桿菌屬和雙歧桿菌屬呈正相關，與擬桿菌屬、Mucispirillum屬和Colidextribacter屬呈負相關。丙酸與Candidatus_Saccharimonas屬呈正相關，與顫桿菌屬和Colidextribacter屬呈負相關。丁酸和2-甲基丁酸與Akkermansia屬、乳酸桿菌屬和Candidatus_Saccharimonas屬呈正相關。

益生菌可能會加重APAP引起的肝損傷的嚴重程度。NsAP中含量豐富的顫桿菌屬、Mucispirillum屬和Colidextribacter屬與肝損傷指數（ALT、AST、HAI和TUNEL陽性率）和炎癥因子（細胞因子和炎癥細胞浸潤）呈正相關。相比之下，乳酸桿菌屬、Candidatus_Saccharimonas屬和SCFAs通常與肝損傷指數、炎癥因子、血清LPS水平和JNK磷酸化呈負相關。此外，抗氧化能力（Bcl-2/Bax比值和SOD活性）與乳酸桿菌、Candidatus_Saccharimonas屬、雙歧桿菌和SCFAs呈正相關。Akt磷酸化水平與Akkermansia屬、乳酸桿菌屬和擬桿菌屬呈正相關。基于綜合分析，該研究揭示了A. muciniphila重塑的微生物群落、微生物代謝功能和A. muciniphila的肝保護作用之間的本質相互作用。

結論

腸道微生物群驅動個體對過量對乙酰氨基酚（APAP）介導的肝毒性的敏感性。在該項研究中，AKK菌的提升有效地減輕了APAP誘導的肝毒性，并降低了血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平。AKK菌顯著減弱APAP誘導的氧化應激和炎癥反應，這可以通過恢復還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）平衡、增強超氧化物歧化酶（SOD）活性、減少促炎細胞因子產生以及減輕巨噬細胞和中性粒細胞浸潤來證明。此外，AKK菌維持腸道屏障功能，重塑受干擾的微生物群落并促進短鏈脂肪酸（SCFA）分泌。AKK菌的有益作用伴隨著轉錄水平肝臟基因表達的改變和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號通路的激活。該結果表明AKK菌可能是APAP誘導的肝損傷的潛在預處理。

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