關(guān)鍵詞：AKK菌、AKK菌格林汁
特應(yīng)性皮炎（AD），又名特應(yīng)性濕疹，是一種常見于嬰兒和兒童的慢性炎癥性疾病，通常會(huì)持續(xù)到成年，為患者帶來了嚴(yán)重的身體、心理、生活負(fù)擔(dān)。
在AD的發(fā)病機(jī)制中，過敏原暴露導(dǎo)致T輔助2（Th2）細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致Th1和Th2細(xì)胞之間的不平衡，從而增加免疫球蛋白E（IgE）的產(chǎn)生。這些反應(yīng)最初由胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）驅(qū)動(dòng)，隨后觸發(fā)樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的Th2炎癥反應(yīng)。雖然目前外用類固醇作為AD的主要治療手段，但長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致皮膚干燥、皮膚厚度減少、血壓升高、腎功能下降等嚴(yán)重的副作用。
因此，有必要開發(fā)一種從嬰兒到老年人的安全有效的AD治療方法。AD的人源微生物組研究應(yīng)發(fā)展為更安全、更有效的AD治療。
最近的研究表明腸道菌群失調(diào)與AD之間存在相關(guān)性。腸道菌群失調(diào)的代謝物可以進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并在皮膚中積聚，損害表皮分化和皮膚屏障的完整性，最終對(duì)皮膚功能產(chǎn)生負(fù)面影響。在一項(xiàng)臨床研究中，對(duì)AD患者糞便樣本的宏基因組分析顯示，與對(duì)照患者相比，普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）種類顯著減少，并且在AD患者中觀察到糞便短鏈脂肪酸（SCFA），尤其是丁酸鹽的減少。F. prausnitzii是一種生活在人體腸道中的專性厭氧菌，約占健康成年人腸道微生物群的5%。該物種是丁酸鹽生產(chǎn)者，影響生理功能和體內(nèi)平衡以維持健康，它的抗炎活性已得到充分證實(shí)。同時(shí)，Akkermansia muciniphila也是一種專性厭氧菌和粘蛋白降解細(xì)菌，廣泛存在于健康的人體腸道黏膜中，占腸道微生物群的3%。它產(chǎn)生SCFA，主要是丙酸鹽和乙酸鹽，并能夠調(diào)節(jié)宿主的新陳代謝、免疫反應(yīng)和腸道屏障功能。
最近的研究報(bào)告稱，過敏性哮喘和AD兒童的腸道菌群中F. prausnitzii和A. muciniphila的豐度分別降低，這些細(xì)菌的分泌代謝物可能會(huì)誘導(dǎo)抗炎和預(yù)防促炎細(xì)胞因子。然而，這些細(xì)菌的臨床效果尚未完全闡明。該項(xiàng)研究通過使用2,5-二硝基氯苯（DNCB）誘導(dǎo)AD模型，評(píng)估F. prausnitzii和A. muciniphila在具有AD樣癥狀的NC/Nga小鼠中的作用。
F. prausnitzii和A. muciniphila的施用改善了AD相關(guān)標(biāo)志物，例如皮炎評(píng)分、搔抓行為和血清免疫球蛋白E水平。補(bǔ)充F. prausnitzii EB-FPDK11或A. muciniphila EB-AMDK19可能是AD患者的新治療選擇，其中EB-AMDK19似乎具有最高的潛力。
F. prausnitzii和A. muciniphila菌株從7至60歲的健康韓國(guó)人身上采集新鮮糞便樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)。使用PacBio RS II測(cè)序平臺(tái)對(duì)F. prausnitzii EB-FPDK11和A. muciniphila EB-AMDK19的全基因組進(jìn)行測(cè)序。F. prausnitzii參考菌株為F. prausnitzii A2-165（DSM17677），A. muciniphila參考菌株為A. muciniphila BAA-835（ATCC BAA-835）。
六周大的雄性NC/Nga（重約21-25克）在20 ± 3 °C、濕度55 ± 5%的恒定溫度下以12小時(shí)的光照/黑暗循環(huán)飼養(yǎng)適應(yīng)性一周。適應(yīng)后，所有小鼠分為正常對(duì)照（Normal）、DNCB+PBS（DNCB）、DNCB+地塞米松（DEX）、DEX+F. prausnitzii A2-165（A2-165）、DNCB+F. prausnitzii EB-FPDK11（EB-FPDK11）、DNCB+A. muciniphila BAA-835（BAA-835）和DNCB+A. muciniphila EB-AMDK19（EB-AMDK19），n=9。DNCB誘導(dǎo)特應(yīng)性皮炎模型：適應(yīng)一周后使用電子剪和脫毛膏去除所有NC/Nga小鼠的背毛，DNCB溶液在丙酮:橄欖油懸浮液（3:1）中以1%的濃度制備，并涂在小鼠耳朵和背側(cè)皮膚，每周兩次，持續(xù)3周。在EB細(xì)菌菌株給藥期間用0.5% DNCB涂小鼠，每周兩次。A2-165、EB-FPDK11、BAA-835和EB-AMDK 19 組每只小鼠每日口服給藥200 μL含1 × 108 CFUs各自菌株的無菌PBS，持續(xù)6周。正常組和DNCB組小鼠被施用200 μL無菌PBS。DEX組作為陽性對(duì)照，用蒸餾水將地塞米松稀釋至60 μg/mL，每天200 μL口服給藥。在DNCB處理三周后，每周評(píng)估一次皮炎嚴(yán)重程度，測(cè)定抓撓頻率。在研究的最后一天取實(shí)驗(yàn)小鼠的背部皮膚、耳朵和大腸組織進(jìn)行組織學(xué)分析和免疫組織化學(xué)分析。在9周處理期結(jié)束時(shí)，處死小鼠收集血樣測(cè)定總血清IgE和細(xì)胞因子。從腸中分離總RNA進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）分析。此外還進(jìn)行短鏈脂肪酸（SCFA）分析，通過氣相色譜（GC）測(cè)量接種前培養(yǎng)基和培養(yǎng)物上清液中乙酸鹽、丁酸鹽、丙酸鹽的濃度。
F. prausnitzii和A. muciniphila的細(xì)菌菌株該研究從健康的韓國(guó)人中分離出約80種不同菌株組成的菌株庫，基于例如（1）使用人類細(xì)胞系如HT-29 37的抗炎活性，（2）使用Caco-2細(xì)胞系的跨上皮電阻（TEER）值，和（3）基于使用小鼠BMDCs產(chǎn)生的IL-10和IL-12的免疫調(diào)節(jié)活性從F. prausnitzii 菌株庫中選擇F. prausnitzii EB-FPDK11。A. muciniphila EB-AMDK19菌株在先前的研究中有所描述。該研究進(jìn)行全基因組測(cè)序以表征菌株的基因組特征，顯示了兩種菌株的基因組特征以及各自的類型菌株（F. prausnitzii ATCC 27768[系統(tǒng)群I類型菌株]、F. prausnitzii A2-165[系統(tǒng)群II類型菌株]和A. muciniphila BAA-835）。簡(jiǎn)而言之，F(xiàn). prausnitzii EB-FPDK11 的基因組大小約為2.8 Mb和2579個(gè)編碼序列（CDS），小于典型菌株的基因組大小。ANI分析表明F. prausnitzii EB-FPDK11分別與ATCC 27768和A2-165具有84.7%和97.5%的序列同一性。同時(shí)，A. muciniphila EB-AMDK19的基因組大小約為2.7 Mb，有2195個(gè)CDS，比典型菌株大。A. muciniphila EB-AMDK19的ANI分析顯示與ATCC BAA-835的序列同一性為97.6%。
口服F. prausnitzii和A. muciniphila減輕DNCB誘導(dǎo)的NC/Nga小鼠AD樣癥狀為研究EB-FPDK11或EB-AMDK19給藥是否可以有益地影響AD模型，除正常組外的所有實(shí)驗(yàn)組NC/Nga小鼠接受DNCB處理3周，然后各處理組分別接受地塞米松（DEX）、F. prausnitzii A2-165（A2-165）、F. prausnitzii EB-FPDK11（EB-FPDK11）、A. muciniphila BAA-835（BAA-835）或A. muciniphila EB-AMDK19（EB-AMDK19）治療持續(xù)6周，此時(shí)小鼠中已經(jīng)出現(xiàn)AD樣病變，包括伴有抓撓、干燥和表皮剝脫的水腫性紅斑。用DNCB處理3周導(dǎo)致嚴(yán)重皮炎的發(fā)展，在所有實(shí)驗(yàn)組中皮炎評(píng)分約為8。DNCB組在6周治療期間皮炎評(píng)分幾乎沒有任何變化，而與DNCB組相比，每日接受地塞米松或108 CFUs相應(yīng)菌株的組的評(píng)分顯著降低（DEX：51%；A2-165：32%；EB-FPDK11：34%；BAA-835：53%；EB-AMDK19：69%）。
組織學(xué)上，與DNCB組相比，DEX、EB-FPDK11、BAA-835和EB-AMDK19給藥大大減輕了耳部皮膚病變的病理變化，如角化過度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但A2-165組在耳部皮膚病變中沒有明顯的變化。同樣，與DNCB組相比，除了A2-165組在其他治療組中觀察到耳朵厚度顯著減少（正常：0.55±0.03 mm，DNCB：1.50±0.07 mm，EB-FPDK11：1.16±0.06 mm，BAA-835：1.1±0.06 mm，EB-AMDK19：0.87±0.04 mm）。同時(shí)，對(duì)抓撓行為進(jìn)行計(jì)數(shù)以評(píng)估對(duì)皮膚瘙癢的影響。重復(fù)局部應(yīng)用DNCB導(dǎo)致正常組抓撓行為增加7.5倍。相比之下，所有治療組的抓撓行為均顯著減少，與DNCB組相比，EB-FPDK11和EB-AMDK19組分別減少了76.2%和72.9%。
圖EB-FPDK11和EB-AMDK19可有效預(yù)防NC/Nga小鼠的AD樣病變癥狀
圖EB-FPDK11和EB-AMDK19對(duì)DNCB誘導(dǎo)的AD樣小鼠脾臟和總血清IgE水平的影響
F. prausnitzii和A. muciniphila處理對(duì)NC/Nga小鼠IgE水平和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響該研究進(jìn)行了一項(xiàng)特應(yīng)性動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，每周兩次施用1% DNCB持續(xù)3周，然后每周兩次施用0.5% DNCB持續(xù)6周。根據(jù)前人研究的說法，這種環(huán)境可能會(huì)誘導(dǎo)局部和全身免疫反應(yīng)。AD不僅會(huì)引起局部皮膚病變，還會(huì)引起全身反應(yīng)，影響脾臟、骨髓和淋巴結(jié)等內(nèi)部組織和器官。脾臟含有一系列免疫細(xì)胞，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。因?yàn)槠⒛[大表明免疫系統(tǒng)功能異常，文章研究了EB-FPDK11或EB-AMDK19給藥是否影響免疫系統(tǒng)功能。與正常組相比，DNCB組脾臟重量顯著增加2.3倍，與DNCB組相比，地塞米松、EB-FPDK11株或EB-AMDK19株治療顯著抑制了脾重。AD發(fā)展最顯著的特征之一是血清IgE水平升高。與DNCB組相比，所有治療組的血清IgE水平均顯著降低。值得注意的是，EB-AMDK19組的血清IgE降低幅度最大，與BAA-835 組相比甚至更顯著（EB-AMDK19：7572±395.3 ng/mL vs BAA-835：13044±1663 ng/mL）。由活化的肥大細(xì)胞釋放的組胺通過增加血管通透性允許免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到組織中。因此，為減少AD等自身免疫性疾病中的過敏反應(yīng)，有必要控制活化的肥大細(xì)胞。該研究分別用甲苯胺藍(lán)和剛果紅溶液處理各組的背部皮膚組織對(duì)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行染色，以檢查DNCB誘導(dǎo)的治療組肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到皮膚病變中的影響。DNCB局部處理后浸潤(rùn)真皮層的炎癥細(xì)胞數(shù)量增加，與正常組相比，肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞分別增加13.0±1.3倍和14.7±3.9倍。與DNCB組相比，治療組肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。DEX組與BAA-835或EB-AMDK19組的肥大細(xì)胞數(shù)量無顯著差異。有趣的是，EB-AMDK19組的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量減少幅度最大，甚至顯著低于DEX組。因此，這些結(jié)果表明A. muciniphila和F. prausnitzii菌株的施用抑制了DNCB誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)到皮膚病變中，其中EB-AMDK19似乎是最有效的。
圖 EB-FPDK11和EB-AMDK19在DNCB誘導(dǎo)的AD樣小鼠中抑制肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到真皮中圖 EB-FPDK11和EB-AMDK19增強(qiáng)NC/Nga小鼠AD樣病變中的皮膚屏障蛋白
用F. prausnitzii和A. muciniphila菌株治療的NC/Nga小鼠受損皮膚狀況的改善AD的病理生理學(xué)涉及皮膚屏障和免疫功能異常。受損的表皮緊密連接（TJ）蛋白，如ZO-1、claudin-1和occludin可以解釋皮膚屏障失調(diào)的許多后果，例如，AD患者的TJ蛋白水平降低。絲聚蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞衍生自絲聚蛋白原的蛋白質(zhì)。它在表皮中起著重要的結(jié)構(gòu)和功能作用，有助于皮膚穩(wěn)態(tài)。此外它對(duì)AD和過敏性疾病的發(fā)展也至關(guān)重要，即使沒有絲聚蛋白突變，它在AD患者中的表達(dá)也顯著降低。該研究進(jìn)行了組織學(xué)染色以確定施用菌株對(duì)特應(yīng)性皮膚病變的影響。H&E染色顯示DNCB處理后角化過度、增生和AD病變。與正常組相比，DNCB組的表皮厚度增加了3.6倍。與 DNCB 組相比，A. muciniphila和F. prausnitzii菌株的施用顯著降低了角化過度和增生。接下來使用免疫組織化學(xué)確定絲聚蛋白的表達(dá)。與正常組相比，DNCB組皮膚中的聚絲蛋白表達(dá)降低，而在用A. muciniphila或F. prausnitzii菌株處理的組中則有所減輕。因?yàn)閆O-1和Claudin1在AD患者的皮膚病變中的低表達(dá)，該研究使用免疫組織化學(xué)檢查ZO-1和Claudin-1的表達(dá)水平以評(píng)估表皮中的TJ屏障功能。DNCB組的ZO-1和claudin-1蛋白水平低于正常組，EB-FPDK11、BAA-835和EB-AMDK19治療組的恢復(fù)與正常組相似。TSLP激活樹突狀細(xì)胞以將輔助T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，這對(duì)于誘發(fā)特應(yīng)性皮炎的癥狀至關(guān)重要。當(dāng)測(cè)定皮膚中TSLP的水平時(shí)，DEX、EB-FPDK11、BAA-835和EB-AMDK19組的水平顯著低于DNCB組。此外，使用免疫組織化學(xué)測(cè)定法測(cè)定皮膚中IL-4細(xì)胞因子的水平表明，DNCB誘導(dǎo)組的IL-4水平升高，然而，在所有給予EB菌株的組中，IL-4水平顯著降低，包括陽性對(duì)照地塞米松。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明EB-FPDK11和EB-AMDK19給藥可通過調(diào)節(jié)絲聚蛋白、ZO-1、Claudin-1、TSLP和IL-4有效減少DNCB誘導(dǎo)的皮膚屏障異常。通過用F. prausnitzii和A. muciniphila菌株治療DNCB誘導(dǎo)的AD樣小鼠調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞因子之間的平衡AD的特點(diǎn)是主要的Th2免疫反應(yīng)源自多種細(xì)胞因子，包括IL-4和IL-13。特別是，IL-4是 Th2 細(xì)胞分化和IgE產(chǎn)生的關(guān)鍵Th2細(xì)胞因子。IL-6由活化的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，并通過誘導(dǎo)IL-4啟動(dòng)幼稚CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞的極化。最近的臨床研究顯示抑制IL-6受體可改善AD。當(dāng)測(cè)定與Th2反應(yīng)相關(guān)的IL-4和IL-6細(xì)胞因子水平的變化時(shí)，與正常組相比，DNCB組血清中的相應(yīng)細(xì)胞因子顯著升高，但在菌株給藥組顯著被抑制。相比之下，與DNCB組相比，治療組中IL-10的水平幾乎沒有任何變化，IL-10在AD中起抑制作用。該研究還測(cè)定了與Th1反應(yīng)相關(guān)的IL-12和IFN-γ的各自水平，發(fā)現(xiàn)與正常組相比它們?cè)贒NCB組中顯著下調(diào)。與DNCB組相比，所有治療組的IL-12水平均顯著升高。特別是EB-AMDK19組的IL-12水平顯著高于BAA-835組。同時(shí)，與DNCB組相比，僅EB-AMDK19組的IFN-γ水平顯著升高。最近關(guān)于特應(yīng)性和哮喘的研究表明，總IgE水平與產(chǎn)生IL-4/IFN-γ的細(xì)胞的比率呈正相關(guān)。此外，Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)比Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)更普遍，并且在AD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。這些發(fā)現(xiàn)表明Th2/Th1平衡與特應(yīng)性狀態(tài)有關(guān)。因此，實(shí)驗(yàn)研究了菌株治療對(duì)Th2/Th1免疫平衡的影響，并分析Th2和Th1相關(guān)細(xì)胞因子的比例。與正常組相比，DNCB組的Th2/Th1、IL-4/IFN-γ比值平均增加了約1.3倍。所有處理組都抑制了Th2/Th1比率的增加。因此，這些結(jié)果表明給予F. prausnitzii和A. muciniphila菌株可以抵消DNCB誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的不平衡。
圖口服EB-FPDK11和 EB-AMDK19可減輕DNCB誘導(dǎo)的AD（如Nc/Nga小鼠）中的Th2/Th1細(xì)胞因子失衡圖 EB-FPDK11和EB-AMDK19促進(jìn)DNCB誘導(dǎo)的結(jié)腸損傷維持腸上皮屏障功能用EB-FPDK11和EB-AMDK19治療NC/Nga小鼠減輕DNCB誘導(dǎo)的結(jié)腸損傷該研究檢查了結(jié)腸形態(tài)和腸道屏障功能，以研究菌株對(duì)DNCB誘導(dǎo)的腸道屏障功能障礙的影響。結(jié)腸H&E染色顯示DNCB處理引起嚴(yán)重的黏膜損傷：與正常組相比，由于炎癥絨毛形狀不規(guī)則，并且長(zhǎng)度顯著縮短（DNCB：0.19±0.02 mm vs正常：0.51±0.03 mm）。與DNCB組相比，治療組的絨毛長(zhǎng)度似乎有所恢復(fù)，并且僅在EB-FPDK11、BAA-835和EB-AMDK19 組中顯著。杯狀細(xì)胞是柱狀上皮細(xì)胞，負(fù)責(zé)分泌粘蛋白并起到保護(hù)上皮的腸道屏障的作用。因此，該研究調(diào)查了實(shí)驗(yàn)組中杯狀細(xì)胞是如何受到影響的。結(jié)腸組織用阿爾新藍(lán)/PAS染色后發(fā)現(xiàn)，DNCB組杯狀細(xì)胞數(shù)量較正常組減少2倍。而與DNCB組相比，BAA-835組和EB-AMDK19組杯狀細(xì)胞數(shù)量分別顯著增加1.6倍和1.7倍。接下來使用免疫組織化學(xué)檢查結(jié)腸中ZO-1蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)僅在EB-AMDK19組中表達(dá)水平明顯增加。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，該研究還在轉(zhuǎn)錄水平測(cè)量了ZO-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它在DEX、A2-165和BAA-835組中趨于增加，或者在EB-FPDK11和EB-AMDK19組中顯著增加。這些結(jié)果表明，施用EB-FPDK11或EB-AMDK19不僅減輕了DNCB誘導(dǎo)的結(jié)腸損傷，而且改善了由過敏性化合物引起的腸屏障功能障礙。最后，該研究通過qPCR量化結(jié)腸中抗炎（IL-10）或促炎（IL-6和IL-13）細(xì)胞因子的水平來研究對(duì)腸道黏膜免疫細(xì)胞的影響。與正常組相比DNCB組中IL-13相對(duì)mRNA水平顯著升高2.9倍，治療組較DNCB組顯著降低，EB-AMDK19 組中IL-13相對(duì)mRNA水平最低。IL-6水平也顯示出與IL-13相似的趨勢(shì)，但這僅在A2-165和EB-AMDK19組中顯著。相比之下，與正常組相比DNCB組中IL-10的相對(duì)mRNA水平顯著降低77% ±3%，并且僅在EB-AMDK19 組中上調(diào)，顯示出3.39倍的增加。
總之，該研究結(jié)果表明，F(xiàn). prausnitzii和A. muciniphila的施用改善了AD相關(guān)標(biāo)志物，例如皮炎評(píng)分、搔抓行為和血清免疫球蛋白E水平。此外，F(xiàn) . prausnitzii和A. muciniphila治療降低了胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）的水平，觸發(fā)了T輔助（Th）2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并改善了DNCB誘導(dǎo)的Th1和Th2免疫反應(yīng)之間的不平衡。同時(shí)，菌株的口服給藥增強(qiáng)了皮膚中絲聚蛋白和腸道屏障中ZO-1的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致功能恢復(fù)。特別是，EB-AMDK19或EB-FPDK11的改進(jìn)似乎分別優(yōu)于BAA-835或A2-165。主要是，EB-FPDK11和EB-AMDK19 與廣泛用于AD治療的類固醇藥物地塞米松相比，在抗過敏作用方面似乎具有相似或更好的功效。因此，補(bǔ)充F. prausnitzii EB-FPDK11或A. muciniphila EB-AMDK19可能是AD患者的新治療選擇，其中EB-AMDK19似乎具有最高的潛力。然而，需要進(jìn)行臨床研究以確認(rèn)EB-FPDK11和EB-AMDK19在人體中的功效。
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