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AKK菌可通過調(diào)節(jié)TMAO誘導(dǎo)的心臟焦亡來預(yù)防心房顫動
2022-08-04
關(guān)鍵詞：AKK菌、AKK菌格林汁
心房顫動（AF）是世界范圍內(nèi)最常見的心律失常之一，在普通人群中的患病率為1-2%。冷暴露是AF最重要的獨立危險因素之一。據(jù)報道，環(huán)境溫度每降低1℃，房顫的發(fā)病率增加3%。更重要的是，低溫與AF患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，包括心血管事件和全因死亡率的顯著增加。然而，與寒冷相關(guān)的AF的潛在機(jī)制仍然很大程度上未知。
腸道微生物群由數(shù)千種細(xì)菌和數(shù)萬億微生物細(xì)胞組成，它們可能有助于人類宿主的心血管健康，并且當(dāng)腸道微生物異常時，有助于包括AF在內(nèi)的各種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制。臨床數(shù)據(jù)顯示，房顫患者的腸道微生物功能失衡，代謝模式發(fā)生相關(guān)變化，這增加了差異腸道微生物組特征可用于識別房顫患者的可能性。腸道衍生的代謝物，如血漿氧化三甲胺（TMAO），與AF有關(guān)。已證明局部注射TMAO會增加正常犬的心房電生理學(xué)的不穩(wěn)定性，并通過加劇自主神經(jīng)重構(gòu)來加劇快速心房起搏誘導(dǎo)AF模型中的急性電重構(gòu)。更重要的是，TMAO作為AF患者血栓形成風(fēng)險和缺血性卒中的獨立預(yù)測因素已引起廣泛關(guān)注。
- 研究結(jié)果
在該研究中，冷暴露導(dǎo)致大鼠對心房顫動（AF）的易感性升高，并降低了AKK菌豐度，口服AKK菌改善了冷暴露引起的促房顫特性。橫斷面臨床研究證實寒冷大鼠模型中AKK菌豐度降低在人類受試者中重現(xiàn)，并被證明是與寒冷相關(guān)的AF的獨立危險因素。
- 腸道菌群失調(diào)是與寒冷相關(guān)的AF的原因，口服AKK菌可防止大鼠患上與寒冷相關(guān)的AF，該研究為寒冷相關(guān)AF的機(jī)制提供了新的見解，這可能有助于寒冷相關(guān)AF的治療和預(yù)防。
- 研究內(nèi)容
- 人類隊列研究
在A. muciniphila測試中，在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)療中心在冬季或夏季從初始AF或竇性心律（SR）患者收集糞便樣本。11月至1月因AF或SR入院的患者稱為冬季AF或冬季SR，而6月至8月因AF或SR入院的患者稱為夏季AF或夏季SR。該研究中包括的AF患者被診斷為初始AF。冬季提供糞便樣本的個人被要求連續(xù)暴露在室外寒冷環(huán)境中，每天至少2小時，持續(xù)兩周以上。A. muciniphila測試的862名參與者中有521人被招募到研究中。其中，209人測量了A. muciniphila的糞便豐度被包括在最終分析中。
- 在TMAO測試中，采集了哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病房住院患者的血液樣本。從2019年1月到2019年12月，連續(xù)招募了1873名個體，并納入了1305名測量血漿TMAO的受試者進(jìn)行最終分析。排除標(biāo)準(zhǔn)預(yù)定義如下：檢查時懷孕；過去三個月使用過的抗生素或益生菌；有心力衰竭、癌癥或炎癥性腸病史；過去一周有胃腸道疾病、嘔吐、腹瀉或非典型便秘；過去一周的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。
- 動物實驗
雄性SD大鼠（200-250g）適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，采用完全隨機(jī)化設(shè)計將大鼠隨機(jī)分為兩組：室溫（RT）組升高至25±1℃，冷暴露（Cold）組在SPF條件下的溫度控制和通風(fēng)室中使用單獨通風(fēng)的籠子暴露于中度寒冷（4±1°C）中兩周，n=7。Cold組大鼠通過飲用水給予1.0% 3,3-二甲基-1-丁醇（DMB，膽堿的結(jié)構(gòu)類似物，抑制TMA的產(chǎn)生）2周。在抗焦亡實驗中，通過腹膜內(nèi)注射（2 g/kg/天）將 Necrosulfonamide（NSA，gasdermin D的直接化學(xué)抑制劑）給予Cold組大鼠2周，對照組大鼠給予相同量的緩沖液。在A. muciniphila補(bǔ)充實驗中，Cold組大鼠每天分別以1×109 CFU/200 μL的劑量口服給予A. muciniphila或巴氏殺菌的A. muciniphila與厭氧PBS持續(xù)2周，對照組Cold鼠給予含2.5%甘油的PBS。
C57BL/6遺傳背景中的Caspase1 floxed小鼠（Caspflox/flox）和Mef2c-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，通過將Caspflox/flox小鼠與Mef2c-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，生成Mef2c-Cre驅(qū)動的心房和caspase1的右心室特異性缺失，產(chǎn)生Caspmef2c/mef2c和Caspflox/flox（對照）后代，然后進(jìn)行冷暴露實驗。
從不同的籠子收集冷暴露后房顫易感性顯著增加的3只大鼠的糞便進(jìn)行糞便微生物群移植（FMT）分析。
實驗結(jié)束時，所有動物用戊巴比妥鈉麻醉，進(jìn)行電生理學(xué)分析測定AF的誘導(dǎo)率和持續(xù)時間。頸椎脫位處死后，收集心房組織進(jìn)行免疫熒光染色分析和組織病理學(xué)分析。收集血漿樣本和糞便樣本進(jìn)行LC-MS/MS分析。從糞便樣本中提取微生物DNA進(jìn)行16S RNA測序和微生物分析。
- 體外實驗
從新生Sprague-Daw大鼠（1-3天大）的心臟中分離培養(yǎng)獲得原代大鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，然后分別用TMAO（10 μmol/L）或二甲基亞砜在37℃、5% CO2下培養(yǎng)48小時。
從SD大鼠的股骨中收集骨髓分離培養(yǎng)分化出巨噬細(xì)胞（BMDM）后，在存在或不存在TMAO（10 μmol/L）的情況下孵育48小時。
細(xì)胞共培養(yǎng)模型：將BMDM接種在6孔板中并用巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）處理6天以誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞。然后，用TMAO處理M0巨噬細(xì)胞，同時將預(yù)處理的成纖維細(xì)胞/心肌細(xì)胞接種到具有2mL培養(yǎng)基的上室中。共培養(yǎng)48小時后，用含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA試劑裂解心臟成纖維細(xì)胞/心肌細(xì)胞，提取總蛋白用于蛋白質(zhì)印跡分析。MTT法測定細(xì)胞活力。收集巨噬細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
- 研究內(nèi)容
冷暴露通過誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)促進(jìn)房顫
為分析冷暴露對大鼠房顫易感性的影響，該研究建立了冷動物模型，大鼠在冷溫度（4 ± 1℃）下暴露2周，對照組大鼠在室溫（25±1°C）下飼養(yǎng)。在RT組大鼠中短陣快速起搏很少引起AF，而在Cold組大鼠中通常引起AF。與RT組大鼠相比，在Cold組大鼠中AF誘導(dǎo)率和AF持續(xù)時間明顯升高，這與臨床研究一致。此外，在Cold組大鼠中觀察到比在RT組大鼠中較大的心房膠原沉積和膠原體積分?jǐn)?shù)。相應(yīng)地，冷暴露上調(diào)了大鼠心房纖維化相關(guān)蛋白 TGF-β1和α-SMA的表達(dá)。越來越多的研究強(qiáng)調(diào)腸道微生物群在各種心血管疾病中的關(guān)鍵作用。同時，據(jù)報道腸道微生物群受到環(huán)境溫度的影響。因此，該研究在寒冷暴露的第14天收集糞便樣本進(jìn)行16S rRNA分析。基于未加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）揭示RT和Cold組大鼠的微生物群之間存在明顯的聚類。測量α-多樣性發(fā)現(xiàn)，群落豐富度顯示兩組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而Cold組大鼠的群落多樣性高于RT組大鼠。值得注意的是，在RT組和Cold組之間科水平的前10個差異微生物群的比例發(fā)生了顯著變化，特別是Cold組中A. muciniphila的豐度顯著低于RT組。
此外，還發(fā)現(xiàn)Cold組大鼠腸道通透性受損，這可以通過結(jié)腸組織中zonulin-1、occludin和claudin的表達(dá)降低來證明。
- 為研究微生物群變化在寒冷相關(guān)AF中的重要性，該研究將來自Cold或RT組大鼠的微生物群移植到野生型正常大鼠4周，并通過PCoA分析顯示FMT效率。引人注目的是，移植Cold組菌群的大鼠顯示AF的誘導(dǎo)率和持續(xù)時間顯著增加，而移植RT菌群并未導(dǎo)致AF易感性的可檢測變化。這些發(fā)現(xiàn)證實，與寒冷相關(guān)的AF是由異常的腸道微生物群介導(dǎo)的。
圖左A. muciniphila通過抑制TMA合成來逆轉(zhuǎn)冷暴露引起的TMAO升高&圖右TMAO通過增強(qiáng)M1巨噬細(xì)胞浸潤誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的焦亡
為進(jìn)一步證實細(xì)胞焦亡是寒冷相關(guān)性AF的關(guān)鍵機(jī)制，該研究將gasdermin D的直接化學(xué)抑制劑necrosulfonamide（NSA）通過腹腔注射（2g/kg/天）到Cold組大鼠。NSA處理抑制Cold 組大鼠Casp1-p20和cleaved-GSDMD的表達(dá)。令人驚訝的是，寒冷大鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)的心房膠原蛋白沉積，而在接受NSA處理的寒冷大鼠中觀察到纖維化減弱。此外，NSA處理降低了寒冷大鼠的AF易感性，這可以通過AF誘導(dǎo)性和AF持續(xù)時間的減少來證明。
圖 左NSA處理通過減輕心房焦亡來保護(hù)大鼠免受寒冷相關(guān)的AF&圖右 Caspase1敲除通過抑制心房焦亡來保護(hù)小鼠免受與寒冷相關(guān)的AF
為了進(jìn)一步證實細(xì)胞焦亡在寒冷相關(guān)AF中的關(guān)鍵作用，該研究使用了Casp1mef2c/mef2c小鼠模型，其中caspase1在心房和右心室有條件地缺失，蛋白質(zhì)印跡證實心房中caspase1的成功敲除。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三周的冷暴露增加了野生型小鼠的AF易感性并加劇了心臟焦亡。然后，將Casp1flox/flox小鼠和Casp1 mef2c/mef2c小鼠暴露在寒冷中三周。結(jié)果表明，caspase1敲除降低了小鼠的AF誘導(dǎo)率和AF持續(xù)時間。同時，與Casp1flox/flox小鼠相比，Casp1mef2c/mef2c小鼠心房Casp1-p20和cleaved-GSDMD的表達(dá)顯著降低。更重要的是，在Casp1mef2c/mef2c小鼠中觀察到心房纖維化減輕。此外，DMB處理降低了感冒大鼠中Casp1-p20和cleaved-GSDMD的表達(dá)。總之，這些發(fā)現(xiàn)證實細(xì)胞焦亡在寒冷相關(guān)AF中的關(guān)鍵作用。
為進(jìn)一步測試腸道菌群失調(diào)是否與寒冷相關(guān)的AF相關(guān)，該研究從冬季（冬季AF）或夏季（夏季AF）的AF受試者和冬季的竇性心律受試者（冬季SR）收集糞便樣本或夏季（夏季SR）。值得注意的是，非度量多維標(biāo)度（NMDS）揭示了冬季AF組與其他組之間的微生物組成存在顯著差異。冬季AF組的腸道菌群豐富度（Chao1指數(shù)）明顯高于其他組，而多樣性（Shannon和Simpson 指數(shù)）則沒有差異。測序數(shù)據(jù)顯示，冬季AF組中A. muciniphila的豐度降低。隨后，收集了103名冬季受試者和106名夏季受試者的糞便樣本以證實A. muciniphila豐度的變化，qRT-PCR數(shù)據(jù)證實冬季受試者的A. muciniphila豐度低于夏季受試者。然而，SR組中A. muciniphila的豐度與AF組相當(dāng)。為了進(jìn)一步確定A. muciniphila在寒冷相關(guān)AF中的預(yù)測值，根據(jù)A. muciniphila豐度按A. muciniphila的三分位數(shù)分層檢查了臨床個體中AF的患病率。有趣的是，AF的患病率在冬季呈現(xiàn)出隨A. muciniphila豐度而降低的趨勢，但在夏季則沒有，表明A. muciniphila豐度的降低與寒冷相關(guān)的AF有關(guān)。
研究結(jié)論
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